Deteção de animais transgénicos por PCR
Produção dum plasmídeo recombinante e transformação em E.coli
Objetivo
Introdução
Objetivo
- Deteção por PCR sobre quais os murganhos que incorporaram no seu genoma o gene da xilanase V
- São realizados testes a 12 murganhos, com identificações desde C22 a C33.
- Produção de um plasmídeo recombinante, através da tecnologia do DNA recombinante, e a sua transformação em Escherichia coli
- Para melhor quantificação do sinal obtido, é realizada uma amplificação do DNA das amostras.
- Ligação do vetor pBluescript SK ao fragmento contendo o gene xynV (codificador da xilanase V);
- Transformação de células E. coli, com a consequente integração do vetor nestes procariontes.
- Ensaio E (ensaio de recombinação)
- Ensaio L- (controlo negativo de ligação)
- Ensaio T- (controlo negativo de transformação)
- Ensaio T+ (controlo positivo de transformação)
Resultados
Interpretação de Resultados
Resultados
Interpretação de Resultados
Pesquisa de informação em bases de dados biológicos
- Presença de 4 bandas em 4 animais diferentes, sugere que os indivíduos C233, C26, C29 e C30 tenham incorporado o gene da xilanase V.
Purificação de DNA plasmídico com “minipreps”
- Ensaio E: 52 colónias brancas e 8 colónias azuis
- Ensaio L-: 5 colónias brancas e 0 colónias azuis
- Ensaio T-: 0 colónias brancas e 0 colónias azuis
- Ensaio T+: 0 colónias brancas e 554 colónias azuis
- Ensaio E: presença de colónias azuis pode significar uma falha na ligação entre o vetor e o gene xynV;
- Ensaio L-: presença de colónias brancas pode significar uma mutação no gene da β-galactosidase;
- Ensaio T-: ausência de colónias comprova que a E. coli XL10 não possui qualquer resistência à Ampicilina;
- Ensaio T+: presença de colónias azuis comprova a competência das bactérias utilizadas como células hospedeiras.
Objetivo
- Eficiência das células de E. coli: 5,54×10^7 ncf/μg
Descrição da proteína
Introdução
Descrição do gene
- Isolamento do DNA plasmídico de uma suspensão de bactérias obtidas a partir das colónias brancas do ensaio E anterior;
- Qualificação da pureza do DNA obtido, através de uma eletroforese em gel de agarose, e da quantidade.
- 1. Preparação da E. coli;
- 2. Produção de um lisado celular límpido;
- 3. Isolamento do DNA plasmídico e a sua purificação;
- 4. Quantificação da pureza e quantidade do DNA.
- Número de resíduos: 842 aa (completa)
- Número de acesso da base de dados: UniProtKB: Q70DK5
- Autores da sequenciação/depósito:
- Martinez- Fleites C., Taylos, E.J., Guerreiro, C.I.P.D.,Prates, J.A.M., Ferreira, L.M.A., Fontes, C.M.G.A, Baumann, M.J., Brumer H., Davies, G.J.
- Zverlov,V.V., Schantz,N., Schmitt-Kopplin,P. and Schwarz,W.H
- Perfil enzimático da CtXgh74A: Glicósido Hidrolase 74 da Xiloglucanase do Clostridium thermocellum
- Nome do gene: xghA
- Número de nucleótidos: 2941
- Número de acesso da base de dados: AJ585344
- Autores da sequenciação/depósito:
- Zverlov,V.V., Schantz,N., Schmitt-Kopplin,P. and Schwarz,W.H.
- Zverlov,V.V.
Resultados
Interpretação de Resultados
Descrição da atividade catalítica
Descrição da estrutura 3D da proteína
- Presença de 2 bandas justapostas uma à outra:
- Estrutura 3D da proteína:
- Primeira banda: maior migração logo corresponde ao DNA na forma sobre enrolada;
- Segunda banda: menor migração logo corresponde ao DNA na forma circular relaxada.
- Eletroforese revela a presença de uma quantidade pequena de DNA na amostra.
- Classe de enzima: Glycoside Hydrolase Family 74
- Número da enzima: 1515
- Nomenclatura trivial e sistemática: [(1->6)-alpha-D-xylo]-(1->4)-beta-D-glucan glucanohydrolase
- Mecanismo: Hidrólise das ligações glicosídicas de resíduos Glc não ramificados em xiloglucanos de semente de tamarindo, produzindo XXXG, XLXG, XXLG e XLLG. Tem baixa atividade em carboximetilcelulose, liquenan, hidroxietilcelulose e glucoronoxilano, e nenhuma atividade em xilano, ácido poligalaturônico, arabinoxilano de trigo, ramnogalacturano, curdana, laminarina, galactomanana, galactana, arabinana e paquímano ou celulose amorfa.
- Número de acesso da base de dados: 3.2.1.151
- Autores da caraterização cinética/depósito: Zverlov V.V., Schantz N., Schmitt-Kopplin P., Schwarz W.H.
- Número de acesso da base de dados: Q70DK5
- Autores de sequenciação/depósito:
- Martinez-Fleites, C., Guerreiro, C.I., Baumann, M.J., Taylor, E.J., Prates, J.A.M., Ferreira, L.M.A., Fontes, C.M.G.A., Brumer, H., Davies, G.J.
Perfil de restrição do DNA plasmídico isolado
Objetivo
Introdução
- Constituída por 2 metodologias:
- Quantificação do grau de pureza do DNA obtido, através de uma espetrofotometria;
- Construção do perfil de restrição do DNA plasmídico isolado.
- 1. Espetrofotometria;
- 2. Digestão do plasmídeo com as enzimas BamHI, EcoRI, SmaI e PstI.
- Na metodologia 2, são realizados 6 ensaios:
- C: controlo negativo;
- E1: digestão pela enzima BamHI;
- E2: digestão pela enzima EcoRI;
- E3: digestão pela enzimas SmaI e EcoRI;
- E4: digestão pela enzima SmaI;
- E5: digestão pela enzima PstI.
Tecnologia do DNA Recombinante
Apresentação de Resultados
Resultados
Interpretação de Resultados
- Quociente entre os valores de absorvência a 260 nm e a 280 nm: 7,769
- Concentração do DNA plasmídico isolado: 25,25 µg/mL