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Transcript

Deteção de animais transgénicos por PCR

Produção dum plasmídeo recombinante e transformação em E.coli

Objetivo

Introdução

Objetivo

  • Deteção por PCR sobre quais os murganhos que incorporaram no seu genoma o gene da xilanase V
  • São realizados testes a 12 murganhos, com identificações desde C22 a C33.
  • Constituída por 2 fases:
  • Produção de um plasmídeo recombinante, através da tecnologia do DNA recombinante, e a sua transformação em Escherichia coli
  • Para melhor quantificação do sinal obtido, é realizada uma amplificação do DNA das amostras.
  • Ligação do vetor pBluescript SK ao fragmento contendo o gene xynV (codificador da xilanase V);
  • Transformação de células E. coli, com a consequente integração do vetor nestes procariontes.
  • Realizados 4 ensaios:
  • Ensaio E (ensaio de recombinação)
  • Ensaio L- (controlo negativo de ligação)
  • Ensaio T- (controlo negativo de transformação)
  • Ensaio T+ (controlo positivo de transformação)

Resultados

Interpretação de Resultados

Resultados

Interpretação de Resultados

Pesquisa de informação em bases de dados biológicos

  • Presença de 4 bandas em 4 animais diferentes, sugere que os indivíduos C233, C26, C29 e C30 tenham incorporado o gene da xilanase V.

Purificação de DNA plasmídico com “minipreps”

  • Ensaio E: 52 colónias brancas e 8 colónias azuis
  • Ensaio L-: 5 colónias brancas e 0 colónias azuis
  • Ensaio T-: 0 colónias brancas e 0 colónias azuis
  • Ensaio T+: 0 colónias brancas e 554 colónias azuis
  • Ensaio E: presença de colónias azuis pode significar uma falha na ligação entre o vetor e o gene xynV;
  • Ensaio L-: presença de colónias brancas pode significar uma mutação no gene da β-galactosidase;
  • Ensaio T-: ausência de colónias comprova que a E. coli XL10 não possui qualquer resistência à Ampicilina;
  • Ensaio T+: presença de colónias azuis comprova a competência das bactérias utilizadas como células hospedeiras.

Objetivo

  • Eficiência das células de E. coli: 5,54×10^7 ncf/μg

Descrição da proteína

Introdução

Descrição do gene

  • Constituída por 3 fases:
  • Isolamento do DNA plasmídico de uma suspensão de bactérias obtidas a partir das colónias brancas do ensaio E anterior;
  • Qualificação da pureza do DNA obtido, através de uma eletroforese em gel de agarose, e da quantidade.
  • 1. Preparação da E. coli;
  • 2. Produção de um lisado celular límpido;
  • 3. Isolamento do DNA plasmídico e a sua purificação;
  • 4. Quantificação da pureza e quantidade do DNA.
  • Número de resíduos: 842 aa (completa)
  • Número de acesso da base de dados: UniProtKB: Q70DK5
  • Autores da sequenciação/depósito:
  • Martinez- Fleites C., Taylos, E.J., Guerreiro, C.I.P.D.,Prates, J.A.M., Ferreira, L.M.A., Fontes, C.M.G.A, Baumann, M.J., Brumer H., Davies, G.J.
  • Zverlov,V.V., Schantz,N., Schmitt-Kopplin,P. and Schwarz,W.H
  • Perfil enzimático da CtXgh74A: Glicósido Hidrolase 74 da Xiloglucanase do Clostridium thermocellum
  • Nome do gene: xghA
  • Número de nucleótidos: 2941
  • Número de acesso da base de dados: AJ585344
  • Autores da sequenciação/depósito:
  • Zverlov,V.V., Schantz,N., Schmitt-Kopplin,P. and Schwarz,W.H.
  • Zverlov,V.V.

Resultados

Interpretação de Resultados

Descrição da atividade catalítica

Descrição da estrutura 3D da proteína

  • Presença de 2 bandas justapostas uma à outra:
  • Estrutura 3D da proteína:
  • Primeira banda: maior migração logo corresponde ao DNA na forma sobre enrolada;
  • Segunda banda: menor migração logo corresponde ao DNA na forma circular relaxada.
  • Eletroforese revela a presença de uma quantidade pequena de DNA na amostra.
  • Classe de enzima: Glycoside Hydrolase Family 74
  • Número da enzima: 1515
  • Nomenclatura trivial e sistemática: [(1->6)-alpha-D-xylo]-(1->4)-beta-D-glucan glucanohydrolase
  • Mecanismo: Hidrólise das ligações glicosídicas de resíduos Glc não ramificados em xiloglucanos de semente de tamarindo, produzindo XXXG, XLXG, XXLG e XLLG. Tem baixa atividade em carboximetilcelulose, liquenan, hidroxietilcelulose e glucoronoxilano, e nenhuma atividade em xilano, ácido poligalaturônico, arabinoxilano de trigo, ramnogalacturano, curdana, laminarina, galactomanana, galactana, arabinana e paquímano ou celulose amorfa.
  • Número de acesso da base de dados: 3.2.1.151
  • Autores da caraterização cinética/depósito: Zverlov V.V., Schantz N., Schmitt-Kopplin P., Schwarz W.H.
  • Número de acesso da base de dados: Q70DK5
  • Autores de sequenciação/depósito:
  • Martinez-Fleites, C., Guerreiro, C.I., Baumann, M.J., Taylor, E.J., Prates, J.A.M., Ferreira, L.M.A., Fontes, C.M.G.A., Brumer, H., Davies, G.J.

Perfil de restrição do DNA plasmídico isolado

Objetivo

Introdução

  • Constituída por 2 metodologias:
  • Quantificação do grau de pureza do DNA obtido, através de uma espetrofotometria;
  • Construção do perfil de restrição do DNA plasmídico isolado.
  • 1. Espetrofotometria;
  • 2. Digestão do plasmídeo com as enzimas BamHI, EcoRI, SmaI e PstI.
  • Na metodologia 2, são realizados 6 ensaios:
  • C: controlo negativo;
  • E1: digestão pela enzima BamHI;
  • E2: digestão pela enzima EcoRI;
  • E3: digestão pela enzimas SmaI e EcoRI;
  • E4: digestão pela enzima SmaI;
  • E5: digestão pela enzima PstI.

Tecnologia do DNA Recombinante

Apresentação de Resultados

Resultados

Interpretação de Resultados

  • Quociente entre os valores de absorvência a 260 nm e a 280 nm: 7,769
  • Concentração do DNA plasmídico isolado: 25,25 µg/mL
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