Tecnicas en biologia celular y molecular

Técnicas en biología celular y molecular

Uso de radioisotopos

Radioisótopo

Rastreador

Inestable

Desintegración

Radiación: liberación de partículas

Sustancia

Se puede marcar con fluorescencia

Átomo

Su identidad y propiedades se deben al número de protones

Isótopos

Isótopos

Referencias

Son aquellos que poseen igual cantidad de protones y diferente de neutrones

Isótopos radiactivos son inestables y tienden a desintegrarse

Liberación de energía y radiación

• Karp, Biología celular y molecular 6ta edición, paginas 731 a 740
• http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/precipitacio_fonament.html
• https://prezi.com/44szdw-qkqju/precipitacion-selectiva/

Cultivo celular

Desarrollo de medios para el crecimiento

Cultivos ricos en nutrimentos

Obtención de cultivo

Lavado del tejido ---> solución salina sin iones Ca2+

Espectrofotometría por centelleo en líquido

Medición de radiactividad

Moléculas fosforescentes

Mezcla ---> instrumento de conteo

Autorradiografía

Localización de isótopo específico

Aislamiento, purificación y fraccionamiento de proteínas

Cromatografía de intercambio iónico

Depende de los enlaces iónicos de la proteína con la matriz inerte (resinas).

• DEAE - celulosa +
• CM - celulosa -

La resina se empaca en la columna y la solucion de proteínas pasa por la columna. Se da la unión de algunas proteínas de acuerdo a su carga.

Cromatografía de filtración en gel

El material de separación son cuentas diminutas (polisacáridos) que se empacan en la columna.

• Las mas pesadas salen mas rápido.

• Polisacáridos distinta porosidad

• Proteínas fluyan dentro y fuera de las cuencas

Precipitación Selectiva

Cromatografía líquida en columna

Se realiza en una preparación muy impura y busca un gran aumento en la actividad especifica

La purificación se logra por adición gradual de una solución saturada

Precipitación proteínas aumenta

Entre mas

adición de sal

• Propiedades de solubilidad

Técnica en la

que una mezcla de componentes disueltos se fracciona a su paso

por cierto tipo de matriz porosa.

Distribución cadenas hidrofilicas e hidrofobicas

Equilibrio entre las interacciones proteina-solvente

Fase inmóvil

Las proteínas que van

a fraccionarse se disuelven

en un solvente y luego se

pasan por la columna.

Conforme las moléculas

de proteína individual interactúan

con los materiales de la matriz, su progreso por la

columna se retrasa.

SULFATO DE AMONIACO

Cromatografía por afinidad

Determinación de las proteína proteína

Aprovecha las propiedades estructurales únicas de una proteína, lo que permite que una especie de proteína se retire de manera específica de la solución mientras que las demás quedan en ésta

- Sistema de dos híbridos de levadura

• Purificación proteínas se da a través de eliminación de contaminantes.
• Técnicas sucesivas que aprovecha diferentes propiedades de las proteínas.

depende de la expresión de un gen reportero, cuya actividad es

fácil de vigilar mediante una prueba que detecta un cambio de color en presencia de la enzima en una población de células de levadura.

Purificación se mide como incremento en la actividad especifica

FRACCIONAMIENTO CONTENIDO DE UNA CELULA POR CENTRIFUGACION DIFERENCIAL

3. Se repite el proceso y cada vez se aumenta la velocidad.

75.000 revoluciones

por minuto

ULTRACENTRIFUGA

Microsomas

4. El sobrenadente que queda es la fase soluble de la célula y no se puede sedimentar

Fragmento de membranas vacuolares del citosol y ribosomas

Puede usarse en

sistemas sin célula

Los organelos conservan su actividad normal

• Síntesis de proteínas unidas a la membrana
• Formación vesículas de transporte
• Trasporte de solutos y desarrollo de gradientes iónicos

https://www.tplaboratorioquimico.com/laboratorio-quimico/materiales-e-instrumentos-de-un-laboratorio-quimico/centrifuga-de-laboratorio.html

Procedimiento

Es un método utilizado para separar los organelos de una célula, de acuerdo a su tamaño y densidad.

1. Rotura mecánica de la célula por Homogeneizador

• Membrana citoplasmática se fragmenta
• Se fusionan para formar vesículas (diferentes organelos)
• Diferentes propiedades
• Se da en una solución amortiguadora isotónica (sacarosa)

figura 8.5 Pag.270 Biología molecular y celular, Karp

2. Homogeneizado se somete a centrifugación

Mas densos y de gran tamaño

Migran mas rápido al fondo.

http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/centrizonal.htm

Centrifugación diferencial no produce preparaciones puras de los organelos

FRACCIONAMIENTO A TRAVES DE UN GRADIENTE DE DENSIDAD

figura 18-23 Pag. 734 Biología molecular y celular, Karp

Principios:

• Fuerza centrifuga
• Densidades