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Objetivo:

-Avaliar um método de identificação e quantificação de LAA e DIAA em geleias de frutas.

A repetitividade, linearidade e a recuperação foram verificadas.

QUANTIFICAÇÃO DOS ISÔMEROS ÁCIDO L-ASCÓRBICO E ÁCIDO D-ISO-ASCÓRBICO EM GELEIAS DE FRUTAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA

Raquel Grando de Oliveira, Helena Teixeira Godoy e Marcelo Alexandre Prado.

Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade de Campinas, CP 6121, 13083-862

Campinas - SP, Brasil.

Publicado na web em 31/1/12

Definição e funções.

Reagentes e padrões:

-Brometo de hexadecil trimetil amônio. (Sigma)

-Fosfato de sódio anidro. (Merck)

-Acetato de sódio. (Merck)

-Ácido meta-fosfórico. (Merck)

-Na2EDTA. (Reagen)

-Padrões LAA e DIAA - 99%. (Synth)

-Água deionizada. (Millipore)

Análise cromatográfica:

- Sistema:

. HP series 1050, com detector de arranjo de diodos acoplado (DAD).

-Tratamento dos dados:

.ChromQuest.

-Coluna:

.Waters Spherisolb ODS-2 (250 x 4,6 mm).

-Fase móvel:

.2,3 mmol L-1 de brometo de hexadecil trimetil amônio, 2,5 mmol L-1 de Na2EDTA, 80 mmol L-1 de fosfato de sódio anidro e 20 mmol L-1 de acetato de sódio, ajustando a pH 4,5 com ácido orto-fosfórico.

-Eluição:

.Isocrática 0,8 mL min-1.

-Detecção:

.265 nm.

Ácido ascórbico:

-

.Importantes características nutricionais. (doenças e envelhecimento)

.Capacidade antioxidante.

-Propriedades físico-químicas.

.Estável em meio seco.

.Degrada na presença de luz.

.Oxida e degrada em solução. (Cu, Fe e álcali)

Métodos de detecção:

-Biológicos: (escorbuto)

.Elevado tempo de análise, alto custo e baixa repetitividade.

-Químicos:

.Método de Tillmans: titulação com DCIP. (fácil aplicação e baixo custo.)

.Interferência por taninos, Cu, Fe, Co, e compostos sufidrílicos além da coloração da amostra.

-Seletivo, linear, LD e LQ adequados alta capacidade de detecção e quantificação.

Validação do método:

-Seletividade: (tempo de retenção, espectro de absorbância e pureza do pico)

.DAD - amostras x padrão.

-Linearidade:

.Curva analítica com 10 diferentes concentrações, variando entre 10 e 200 mg L-1.

-Repetitividade:

. 10 replicatas de padrões, sendo os padrões avaliados em dois níveis de concentração (30 e 100 mg L-1).

. 10 replicatas a amostra de geleia com

morango.

-Limites de detecção e quantificação:

.divisão entre o desvio padrão (s) obtido no teste de repetitividade e o coeficiente angular da curva analítica (S) (R=s/S). LD foi calculado multiplicando R por 3,3 e LQ foi calculado multiplicando R por 10.

.O fator de assimetria (As) foi calculado a 10% da altura da banda cromatográfica (As = b/a; onde “a” é a banda esquerda e “b” a banda direita).

.A resolução dos picos foi calculada com base no tempo de retenção dos picos (tR) e na largura da banda dos mesmos (wb) de acordo com a equação Rs = 2x(tR2 – tR1)/(wb1 + wb2).

.O fator de separação (α) foi calculado de acordo com a equação α = (tR2 – tm)/(tR1 – m), na qual tm é o tempo morto.

Amostras (Klaus J.G. Bouillon

ME) - Geleias de:

-Acerola com morango.

-Laranja.

-Rosela.

-Acerola com goiaba.

-Acerola com rosela.

-Acerola com maná.

-Acerola com maracujá.

-Acerola.

-Acerola e banana.

-Goiaba com rosela.

-Métodos de quantificação de AA:

.Vários métodos não diferenciam o LAA do DIAA.

-Métodos cromatográficos:

.Papel e camada delgada. (bons resultados, pouco uso.

.Cromatografia gasosa. (boa linearidade e alta especificidade x derivação do ácido a trimetilsilil éter.)

.Cromatografia líquida de alta eficiência. (alta sensibilidade, especificidade e simplicidade)

Isômeros do ácido ascórbico.

-Taxa de recuperação:

.A taxa de recuperação (REC) foi obtida através da adição de uma concentração conhecida do composto de interesse (Ca) em amostra antes da extração. A taxa é obtida pela diferença entre a concentração do composto encontrado na amostra com a fortificação (Cf) e a amostra sem a fortificação (Ci), de acordo com a equação REC = (Cf – Ci) x 100/Ca. Foram realizadas adições em dois níveis de concentração.

-Conclusão:

.O método proposto e avaliado identificou e quantificou os isômeros ácido L-ascórbico e ácido D-iso-ascórbico em geleias de frutas. O método demonstrou ser seletivo, linear, repetitivo e com elevado grau de recuperação. O DIAA não foi encontrado nas amostras. O LAA foi encontrado nas amostras em concentrações de até 605 mg

em 100 g de amostras. Seis amostras apresentaram valores acima da quantidade diária recomendada, três mostraram valores acima da IDR para até duas porções e em apenas uma geleia não foi encontrado o ácido ascórbico.

Grupo:

-Cíntia Silva Vidigal - 03

-Karen Sakane Onga - 13

-Leonardo Campos Gomes - 17

.Desvio padrão. (3%)

.Separação e resolução dos picos. (resolução - 34,68/>1,5, separação 1,21/>1)

.Simetria. (1,2 e 1,3/<1,5)

.Tempo de eluição. (10,58 +/- 0,06 min e 12,32 +/- 0,07 min)

.Linearidade. (C.C >0,99)

.LD e LQ. (LAA 7 e 21 mg L-1 / DIAA 5 e 14 mg L-1)

.Recuperação. (87 e 105%)

A extração foi feita com alíquotas de 0,5 g de geleia. A amostra foi diluída e homogeneizada em 50 mL de ácido meta-fosfórico 1% por 3 min. O resultante foi centrifugado por 5 min a 3000 rpm, o sobrenadante foi filtrado em poros de 0,45 μm e aplicado à análise por CLAE.

-Resultados e discussão:

. Procedimento embasado no oficial (AOAC), com algumas mudanças. (Solvente, MPA-1%, homogeneização, sonicador-3min.

-Testes:

.Solução tampão de fosfato de sódio e o par iônico catiônico brometo de hexadecil trimetil amônio como fase móvel.

.EDTA e C18.

-Validação do sistema:

.Seletividade - tempo de retenção.

.Repetitividade - soluções de 30 e 100 mg L-1. (padrões - âmbar, baixa temperatura, vedados.)

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