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Objetivo:
-Avaliar um método de identificação e quantificação de LAA e DIAA em geleias de frutas.
A repetitividade, linearidade e a recuperação foram verificadas.
QUANTIFICAÇÃO DOS ISÔMEROS ÁCIDO L-ASCÓRBICO E ÁCIDO D-ISO-ASCÓRBICO EM GELEIAS DE FRUTAS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA
Raquel Grando de Oliveira, Helena Teixeira Godoy e Marcelo Alexandre Prado.
Departamento de Ciência de Alimentos, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Universidade de Campinas, CP 6121, 13083-862
Campinas - SP, Brasil.
Publicado na web em 31/1/12
Definição e funções.
Reagentes e padrões:
-Brometo de hexadecil trimetil amônio. (Sigma)
-Fosfato de sódio anidro. (Merck)
-Acetato de sódio. (Merck)
-Ácido meta-fosfórico. (Merck)
-Na2EDTA. (Reagen)
-Padrões LAA e DIAA - 99%. (Synth)
-Água deionizada. (Millipore)
Análise cromatográfica:
- Sistema:
. HP series 1050, com detector de arranjo de diodos acoplado (DAD).
-Tratamento dos dados:
.ChromQuest.
-Coluna:
.Waters Spherisolb ODS-2 (250 x 4,6 mm).
-Fase móvel:
.2,3 mmol L-1 de brometo de hexadecil trimetil amônio, 2,5 mmol L-1 de Na2EDTA, 80 mmol L-1 de fosfato de sódio anidro e 20 mmol L-1 de acetato de sódio, ajustando a pH 4,5 com ácido orto-fosfórico.
-Eluição:
.Isocrática 0,8 mL min-1.
-Detecção:
.265 nm.
Ácido ascórbico:
-
.Importantes características nutricionais. (doenças e envelhecimento)
.Capacidade antioxidante.
-Propriedades físico-químicas.
.Estável em meio seco.
.Degrada na presença de luz.
.Oxida e degrada em solução. (Cu, Fe e álcali)
Métodos de detecção:
-Biológicos: (escorbuto)
.Elevado tempo de análise, alto custo e baixa repetitividade.
-Químicos:
.Método de Tillmans: titulação com DCIP. (fácil aplicação e baixo custo.)
.Interferência por taninos, Cu, Fe, Co, e compostos sufidrílicos além da coloração da amostra.
-Seletivo, linear, LD e LQ adequados alta capacidade de detecção e quantificação.
Validação do método:
-Seletividade: (tempo de retenção, espectro de absorbância e pureza do pico)
.DAD - amostras x padrão.
-Linearidade:
.Curva analítica com 10 diferentes concentrações, variando entre 10 e 200 mg L-1.
-Repetitividade:
. 10 replicatas de padrões, sendo os padrões avaliados em dois níveis de concentração (30 e 100 mg L-1).
. 10 replicatas a amostra de geleia com
morango.
-Limites de detecção e quantificação:
.divisão entre o desvio padrão (s) obtido no teste de repetitividade e o coeficiente angular da curva analítica (S) (R=s/S). LD foi calculado multiplicando R por 3,3 e LQ foi calculado multiplicando R por 10.
.O fator de assimetria (As) foi calculado a 10% da altura da banda cromatográfica (As = b/a; onde “a” é a banda esquerda e “b” a banda direita).
.A resolução dos picos foi calculada com base no tempo de retenção dos picos (tR) e na largura da banda dos mesmos (wb) de acordo com a equação Rs = 2x(tR2 – tR1)/(wb1 + wb2).
.O fator de separação (α) foi calculado de acordo com a equação α = (tR2 – tm)/(tR1 – m), na qual tm é o tempo morto.
Amostras (Klaus J.G. Bouillon
ME) - Geleias de:
-Acerola com morango.
-Laranja.
-Rosela.
-Acerola com goiaba.
-Acerola com rosela.
-Acerola com maná.
-Acerola com maracujá.
-Acerola.
-Acerola e banana.
-Goiaba com rosela.
-Métodos de quantificação de AA:
.Vários métodos não diferenciam o LAA do DIAA.
-Métodos cromatográficos:
.Papel e camada delgada. (bons resultados, pouco uso.
.Cromatografia gasosa. (boa linearidade e alta especificidade x derivação do ácido a trimetilsilil éter.)
.Cromatografia líquida de alta eficiência. (alta sensibilidade, especificidade e simplicidade)
Isômeros do ácido ascórbico.
-Taxa de recuperação:
.A taxa de recuperação (REC) foi obtida através da adição de uma concentração conhecida do composto de interesse (Ca) em amostra antes da extração. A taxa é obtida pela diferença entre a concentração do composto encontrado na amostra com a fortificação (Cf) e a amostra sem a fortificação (Ci), de acordo com a equação REC = (Cf – Ci) x 100/Ca. Foram realizadas adições em dois níveis de concentração.
-Conclusão:
.O método proposto e avaliado identificou e quantificou os isômeros ácido L-ascórbico e ácido D-iso-ascórbico em geleias de frutas. O método demonstrou ser seletivo, linear, repetitivo e com elevado grau de recuperação. O DIAA não foi encontrado nas amostras. O LAA foi encontrado nas amostras em concentrações de até 605 mg
em 100 g de amostras. Seis amostras apresentaram valores acima da quantidade diária recomendada, três mostraram valores acima da IDR para até duas porções e em apenas uma geleia não foi encontrado o ácido ascórbico.
Grupo:
-Cíntia Silva Vidigal - 03
-Karen Sakane Onga - 13
-Leonardo Campos Gomes - 17
.Desvio padrão. (3%)
.Separação e resolução dos picos. (resolução - 34,68/>1,5, separação 1,21/>1)
.Simetria. (1,2 e 1,3/<1,5)
.Tempo de eluição. (10,58 +/- 0,06 min e 12,32 +/- 0,07 min)
.Linearidade. (C.C >0,99)
.LD e LQ. (LAA 7 e 21 mg L-1 / DIAA 5 e 14 mg L-1)
.Recuperação. (87 e 105%)
A extração foi feita com alíquotas de 0,5 g de geleia. A amostra foi diluída e homogeneizada em 50 mL de ácido meta-fosfórico 1% por 3 min. O resultante foi centrifugado por 5 min a 3000 rpm, o sobrenadante foi filtrado em poros de 0,45 μm e aplicado à análise por CLAE.
-Resultados e discussão:
. Procedimento embasado no oficial (AOAC), com algumas mudanças. (Solvente, MPA-1%, homogeneização, sonicador-3min.
-Testes:
.Solução tampão de fosfato de sódio e o par iônico catiônico brometo de hexadecil trimetil amônio como fase móvel.
.EDTA e C18.
-Validação do sistema:
.Seletividade - tempo de retenção.
.Repetitividade - soluções de 30 e 100 mg L-1. (padrões - âmbar, baixa temperatura, vedados.)