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BIOLOGIA MOLECULAR

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Clarisa Cosson

on 17 May 2013

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Transcript of BIOLOGIA MOLECULAR

Biología Molecular y Monitoreo de Enfermedades Infecciosas
(SIDA y Hepatitis como ejemplo) BIOLOGÍA MOLECULAR: FUNDAMENTOS Y APLICACIONES EN EL DIAGNÓSTICO Y MONITOREO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS BIOLOGÍA MOLECULAR
Estudia la estructura, función y composición de las moléculas biológicamente importantes: ADN, ARN, proteínas APLICACIONES de la PCR en
el diagnóstico de enfermedades infecciosas PCR:
Técnica de la biología molecular que simula "in vitro" el fenómeno de replicación que ocurre "in vivo", con el fin de amplificar un fragmento de ADN utilizando oligonucleótidos específicos a la secuencia blanco y una polimerasa termoestable PCR MONOPLEX:
Detección cualitativa de una sóla secuencia blanco (1 patógeno) en plasma, suero, orina, heces, secreciones, células mononucleares, líquidos biológicos y otras muestras de interés INTRODUCCIÓN
BIOLOGÍA MOLECULAR
CONCEPTO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
PCR: FUNDAMENTOS TEÓRICOS Y PRÁCTICOS
MODALIDADES DE LA PCR: Monoplex, Multiplex, Nested, Real-time

APLICACIONES DE LA BM EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
APLICACIONES DE LA PCR MONOPLEX
APLICACIONES Y VENTAJAS DE LA PCR MULTIPLEX: Virus respiratorios, Neumonías bacterianas, ITS, VPH, meningitis virales y bacterianas
TIPOS DE MUESTRAS RECOMENDADAS Y CONDICIONES DE TRANSPORTE
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

APLICACIONES DE LA BM EN EL MONITOREO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS
CARGA VIRAL
TIPIFICACIÓN
RESISTENCIA GENOTÍPICA
INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

CONCLUSIONES Gracias PCR REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA Modalidades de la PCR
.- PCR monoplex
.- PCR multiplex
.- Nested-PCR
.- PCR en tiempo real PCR MULTIPLEX:
Detección cualitativa de varios patógenos
en una sóla reacción a partir 1 sóla muestra LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA AL ALCANCE DE PEDIATRAS, NEUMONOLOGOS, INTERNISTAS ¿POR QUE IMPLEMENTAR LA PCR?

Diagnóstico rápido de infecciones respiratorias que conlleva a una terapia temprana disminuyendo las complicaciones asociadas con largos períodos de hospitalización
Despistaje de 15 virus respiratorios asociados con enfermedades respiratorias severas en niños, ancianos y pacientes inmunocomprometidos
Herramienta fundamental para la etiología de las neumonías nosocomiales y comunitarias y tratamiento adecuado LA REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA AL ALCANCE DE LOS GINECO-OBSTETRAS Y UROLOGOS PCR MULTIPLEX PARA LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO PCR APLICADA AL DIAGNOSTICO DIFERENCIAL TEMPRANO DE MENINGITIS

La combinación de un diagnóstico diferencial y una terapia acertada en las etapas iniciales de meningitis pueden reducir significativamente las tasas de morbilidad y mortalidad asociadas
Despistaje de hasta 9 patógenos virales y/o 5 patógenos bacterianos comúnmente asociados a las meningitis en un tiempo de 1-2 días hábiles
Herramienta crítica para elección de un tratamiento adecuado CONCLUSIONES

Los alcances de la Biología Molecular son muy amplios
La técnica de la PCR constituye una herramienta fundamental de la BM
Alta sensibilidad y especificidad para el dx y monitoreo de enfermedades infecciosas
Detección de posibles coinfecciones en una sola reacción y a partir de una sola muestra
A diferencia de los cultivos, la PCR no se afecta con la viabilidad del microorganismo
Las diferentes modalidades de la PCR pueden ser aplicadas para el monitoreo del tratamiento en algunas infecciones crónicas
Cada vez más esta herramienta se considera como un método rutinario ¿POR QUE IMPLEMENTAR LA PCR?

Diagnóstico rápido de patógenos asociados con infertilidad, leucorrea, uretritis, vulvo- vaginitis, enfermedad inflamatoria pélvica
Detección de reservorios asintomáticos para las ITS
Herramienta fundamental en el estudio de la pareja infértil
Diagnóstico temprano y tipificación de VPH para prevención del cáncer cervical y transmisión de la infección Kary Mullis
PCR: a 3 décadas de su invención

HCV

350 millones de personas infectadas
Se estima que alrededor de 25% de los casos de Cáncer Hepato Celular están relacionados con HCV RT mutations associated with RTI-resistance Dispersión de la infección por HIV-1 Carga viral en el tiempo Resistencia Viral Fujigak et al. Genotyping of hepatitis C virus by melting curve analysis with SYBR Green I. Ann Clin Biochem 2004; 41: 130–132. Genotipaje del VHC mediante determinación de Tm 92.08 91.77 93.4 Población viral no idéntica, pero altamente relacionada, sometida a una continua variación y selección y dominada por una variante principal Cuasiespecie Gago et al. 2009. Science 323:1308 Comparación de las tasas de mutación Unos 500.000 pacientes
infectados con alguno
de estos virus Hepatitis y SIDA: un problema de salud mundial
- 350 millones infectados con el VHB
- 170 millones infectados con el VHC
- 34 millones infectados con el VIH América Latina
VHB: 11 millones
VHC: 7 millones
VIH: 1,7 millones SVR
Undetectable HCV RNA at the end of treatment and for at least 24 weeks after completion of treatment

Virological breakthrough
HCV RNA levels initially decrease (even to undetectable levels), followed by a clinically relevant increase while on treatment (usually 1–2 log10), but specific definitions vary between clinical trials

Non-response
HCV RNA levels decrease slowly and to different extents, but never become undetectable null response ,2 log10 decrease in HCV RNA levels by week 12 partial response 2 log10 decrease in HCV RNA levels by week 12, but never undetectable

Relapse
Undetectable HCV RNA levels at completion of treatment, but becoming detectable during follow-up Hepatocellular carcinoma Chronic Adults: 5 -10%
Children: 90% Hepatitis B The hepatitis B virus is transmitted by the parenteral route.

An estimated 2 billion people are infected with HBV.

Chronically affects approximately 350 million people worldwide. P. Deny & F. Zoulim Pathologie Biologie 58 (2010) Interferon Inmunomodulator Tenofovir Hepatitis B Lamivudina
Entecavir
Adefovir
Telvibudina Nucleotides Analogs Nucleosides
Analogs Transcriptase
reverse Inhibitors 104 105 106 C(t) values 104 10 106 C(t) value +/- S.D. Real Time PCR A 10-fold serial dilution should yield a 3.25 cycle difference 8/12 10/16 13/28 2/14 > 15 10- 14 5-9 0-4 60 50 40 30 20 10 0 70 106 105 104 103 102 10 MONITOREO DEL TRATAMIENTO DEL VHC NESTED PCR Y TIEMPO REAL Aplicable principalmente en el diagnóstico de infecciones donde los métodos serológicos no ofrecen una sensibilidad óptima
Despistaje de infecciones donde los marcadores serológicos no discriminan infecciones pasadas de activas
En donde los patógenos involucrados son de dificil y/o lento crecimiento a nivel bacteriológico
Donde se requiere la identificación de determinado patógeno en una muestra biológica específica La PCR NO reemplaza los métodos tradicionales de laboratorio pero constituye una potente herramienta que disminuye significativamente los tiempos de detección y aumenta la probabilidad de detectar el(los) agente(s) etiológico(s) Taq Polimerasa hebra de ADN TERMOCICLADOR:
Permite cambios de temperatura de manera rápida, exacta y cíclica a través del efecto Peltier ELECTROFORESIS PCR multiplex detectó agentes etiológicos para 37 casos (47.4%) que resultaron negativos en estudios convencionales (n 78)
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