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Traducción y Transcripción

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Gustavo Rodriguez

on 6 November 2012

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Transcripción y Traducción Cap. 26 y 27. Lehninger, 5a Ed.
Cap. 29 y 30 del Stryer, 6a Ed. Pero antes!! Preguntas de examen: * Qué es OriC? Señala si las siguientes aseveraciones son falsas o verdaderas:
a) La cadena líder se sintetiza de manera discontinua.
b) La cadena líder se sintetiza de manera continua.
c) La cadena líder se sintetiza en dirección de la horquilla de replicación.
d) La cadena retrasada se sintetiza de manera continua
e) La cadena retrasada se sintetiza de manera discontinua Otra, Otra!! DNA vs RNA Uracilo en vez
de Timina 2 hebras en DNA
1 hebra en RNA Variedad de estructuras secundarias y terciarias. La distinción más importante es que el
el DNA tiene desoxiribosa y el RNA ribosa como azúcar en los nucleótidos. 3 Tipos principales de RNA * RNA mensajero, mRNA ----> Codifica a la secuencia de aminoácidos de una proteína. * RNA de transferencia -----> Carga a los aminoácidos y los lleva al codón correspondiente durante la síntesis de la cadena polipeptídica. * RNA ribosomales, rRNA ----> Parte catalítica, y por lo tanto esencial, en los ribosomas. Pero hay más... muchos más... srpRNAs snRNAs aRNAs gRNAs crRNAs miRNAs siRNAs tasiRNAs rasiRNAs scaRNAs La transcripción es selectiva. Durante la replicación del DNA, se copia todo el genoma, durante la transcripción, se copian sólo regiones discretas. La transcripción está regulada de acuerdo a las necesidades celulares. La suma de todos los RNAs presentes en la célula en una situación particular constituyen al transcriptoma. ...Y más, y más... pero aún nos hace falta saber la función de varios... RNAs polimerasas En 1960 la búsqueda de una enzima capaz de sintetizar RNA culminó con el descubrimiento, por 4 grupos independientes, de la RNA polimerasa. Transcripción vs Replicación El proceso de síntesis de RNA es muy parecido al de la síntesis de DNA: Transcripción vs Replicación Pero también hay diferencias:
* La síntesis de RNA no requiere de un primer.
* La síntesis de RNA requiere NTPs mientras que la síntesis
de DNA requiere dNTPs.
* Después de la replicación, una hebra parental y una hebra hija
de DNA forman una doble hélice estable. Durante la transcrip-
ción, el RNA sólo forma un híbrido DNA-RNA transiente.
* La replicación copia ambas cadenas de DNA completamente.
La transcripción copia regiones de sólo una de las cadenas. Transcripción Igual que la replicación, la transcripción puede dividirse en etapas: 1.- Iniciación

2.- Elongación

3.- Terminación. RNA polimerasa La RNA polimerasa es complejo enzimático con cinco subunidades:
Dos subunidades alfa, una beta, beta' y omega. La subunidad sigma se une sólo de manera transiente. Hay diferentes RNA polimerasas, que difieren principalmente en el tipo de subunidad sigma a la que está unida. La sigma más común se conoce como sigma-70. RNA pol sin proofreading!! La RNApol comete un error cada 10^4-10^5 nucleótidos. Por qué no hay un mecanismo de corrección?? RNA pol sin proofreading!! El asunto no es tan grave porque los RNAs y las proteínas se renuevan constantemente.
Si te equivocas una vez, tienes chance de no hacerlo la próxima vez que sintetizas RNAs. Nota: Algunas polimerasas se detienen un momento cuando agregan un nucleótido incorrecto para corregir el error, pero no se sabe qué tan relevante es este mecanismo en la determinación de la fidelidad de polimerización. Inicio de la transcripción. Al igual que la replicación, la transcripción inicia en sitios definidos. Las RNAs polimerasas se unen a secuencias conocidas como Promotores. Sigma 70 Sitio de unión de subunidad alfa.
Sólo en genes con tasas de expresión elevadas. Inicio de la transcripción. La importancia de los promotores es tal, que una mutación de una sóla base puede disminuir la eficiencia de la unión de RNA polimerasa varios órdenes de magnitud. Una manera experimental de conocer los sitios de interacción proteína+DNA es la técnica conocida como footprinting. Inicio de la transcripción. Una vez que la RNA pol, dirigida por su subunidad sigma, reconoce al promotor, se promueve una separación en un fragmento de +- 10 nucleótidos de las hebras de DNA. Inicio de la transcripción. Ok, ok...
el mecanismo. La subunidad sigma dirige a la RNA pol hacia el promotor. Una vez que la RNA pol está sobre el DNA (y mientras este está intacto) se conoce como Complejo Cerrado. Se promueve la apertura de aproximadamente 10 bases. A esta conformación de DNA+RNA pol se le conoce como Complejo Abierto. El "despeje del promotor" (promotor clearance) marca el inicio de la elongación. La subunidad sigma se libera de manera espontánea. Elongación. Ciclo Sigma. RNA pol+Sigma + DNA Iniciación. Elongación. NusA Sigma Terminación. Reconocimiento de secuencias de terminación NusA Disociación RNA pol - DNA Sigma NusA compite por el mismo sitio de unión que la subunidad sigma. Elongación La elongación del RNA es esencialmente el mismo proceso que la elongación de DNA.

Los nucleótidos entrantes son seleccionados en base a la geometría de enlaces con el DNA molde y el enlace fosfodiester es formado a través de un ataque nucleofílico. Terminación La transcripción es procesiva (todo de un jalón), si el RNA se libera antes de tiempo, la transcripción no puede reanudarse y hay que empezar desde cero otra vez. Sin embargo, si la síntesis de RNA no se detiene a tiempo, es igualmente costoso. Hay dos mecanismos para terminar la transcripción: * Rho dependiente
* Rho independiente. Terminación Rho independiente El transcrito tiene una composición de bases que le permite al RNA adquirir estructuras secundarias. Se crea una estructura de "hairpin" (pasador) que puede:
a) Separar al híbrido DNA+RNA
o
b) Impedir las interacciones DNA+RNA pol.


El resultado neto es la disociación del complejo transcripcional y la terminación de la síntesis de RNA. Terminación Rho dependiente Los terminadores dependientes de Rho cuentan con repetidos CA.

Rho se une al extremo saliente del RNA y migra en la dirección 5'-->3' hasta encontrar a la polimerasa.

Rho contribuye a la disociación del complejo de transcripción, pero el mecanismo por el cual lo hace aún es desconocido. Transcripción en Eucariotes. Aunque el proceso en eucariotes es parecido al de procariotes, en eukarya se necesitan Factores de Iniciación de la transcripción (TFIs), Factores de Elongación y Factores de Terminación. Regulación de la Transcripción La trancripción es regulada en varios niveles: Unión de la RNA pol al promotor. Disponibilidad de subunidades sigma. Elongación Terminación. La regulación es esencial porque la transcripción es el primer paso en la síntesis proteica, un proceso energéticamente caro. MUY caro. Procesamiento de mRNA Una vez sintetizados, la mayoría de los RNAs sufre algún tipo de modificación.

La adición de un "cap" (7-metil-guanosina) al extremo 5' del RNA previene su degradación por ribonucleasas y le permite unirse al ribosoma, Procesamiento de mRNA El transcrito primario incluye exones e intrones. Hay que editar al mRNA para quedarnos sólo con el CDS (coding sequence). La eliminación de los intrones es un proceso autocatalítico!!
(al menos para los de clase I y II),

Los intrones de clase III y IV requieren complejos enzimáticos que catalizen la escisión de las regiones no codificantes. Procesamiento de mRNA En eucariotes, los mensjaeros terminan en una cola de adeninas que es agregada por la Poliadenilato polimerasa. -AAAAAAAAAAAAAA La poli-A permite la unión del mRNA a diferentes proteínas y probablemente evita la destrucción enzimática del mensajero. Nota: En procariotas, la poli-A estimula la degradación del mRNA Procesamiento de mRNA El procesamiento del RNA puede dar lugar a dos proteínas diferentes a partir del mismo transcrito. 3 RNAs polimerasas: Tenemos 3 tipos principales de RNAs, cada uno sintetizado por una polimerasa particular. RNA pol I: rRNAs
RNA pol II: mRNAs
RNA pol III: tRNAs y la mejor manera de recordarlo es con las ramitas. I II III Procesamiento de rRNA Los RNAs 16s, 23s y 5s son transcritos
en la misma unidad. Diferentes enzimas cortan en sitios específicos Nucleasas terminan la edición de los rRNAs para dar lugar a los rNAS activos. Procesamiento de rRNA en eukarya + RNA - Facebook: pre-40s pre-60s 5s Procesamiento de tRNA Se debe agregar el ACC en el extremo 3' para poder cargar un aminoácido en ese lugar.
El extremo 5' es cortado.
El intrón es procesado.
Existen procesos de modificación de bases.
Finalmente tenemos al tRNA funcional. Ribozimas La búsqueda de modificaciones postranscripcionales en los RNAs permitió identificar RNAs catalíticos, a los que se bautizó como Ribozimas. Inicialmente se creía que solo los RNAs podían tener actividad catalítica, pero actualmente, hay ejemplos de DNA catalítico también. Ejemplos de RNAs catalíticos:
a) Intrones de tipo I y II.
b) RNAsa P
c) rRNAs de polimerasas.... Flujo de la información genética DNA RNA Proteínas RNA--> DNA Aunque el flujo de información RNA-->DNA había sido predicho desde 1962, fue hasta 1970 que se descubrió a la Transcriptasa Reversa. RNA--> DNA Estructura y organización de un genoma retroviral. Transcriptasa Reversa Es la enzima clave en la replicación de los retrovirus. Cataliza 3 procesos fudamentales:
a) Síntesis de DNA a partir del RNA genómico viral.
b) Degradación del RNA viral en el dúplex DNA+RNA
c) Síntesis de DNA complementario a la cadena de DNA
sintetizada. La transcriptasa reversa se equivoca 1 vez cada 20 000 nucleótidos. Cuáles crees que sean las consecuencias? Transcriptasa Reversa La transcriptasa reversa se ha convertido en una pieza clave en el estudio de intereacciones RNA-DNA y en la síntesis de DNA complementario al mensajero maduro de un gen (cDNA). RNA --> RNA Algunos virus, como el Q-beta, son de RNA pero no tienen transcriptasa reversa.

En su lugar, incluyen una RNA polimerasa dependiente de RNA: replicasa. Las replicasas son selectivas por el RNA viral. RNA --> DNA ¡¡Break!! Traducción:
Síntesis de Proteínas Cap. 27; Lehninger 5a Ed.
Cap. 30; Stryer 6aEd Las proteínas se sintetizan en ribosomas Experimentos con aa radioactivos y ratas demostraron que las proteínas se sintetizan en lugares específicos, a los que luego se llamó Ribosomas. Los aminoácidos se cargan en tRNAs Los tRNAs leen tripletes de RNA Francis Crick propuso que un "adaptador" debía ser el link entre la secuencia de RNA y la secuencia proteica. Posteriormente se demostró que los tRNA son quienes llevan el aminoácido al triplete correcto. Una aminoacil-tRNA sintetasa es la que carga el aminoácido en el tRNA correspondiente Pregunta: Por qué se necesitan tres bases para codificar un aminoácido ? ? Los mRNAs se leen de manera continua. Los tripletes son continuos, es decir, no sobrelapan entre sí. Cada secuencia de DNA puede leerse en tres marcos de lectura diferentes. Degeneración del código genético. El código genético es redundante (degenerado) pero no ambigüo. Bamboleo Cuando varios codones codifican para el mismo aminoácido, la diferencia usualmente recae en la tercera base, de modo que las primeras dos letras son las que determinan primordialmente el aminoácido codificado.

Un tRNA puede reconocer dos o más codones que codifican para el mismo aminoácido si las dos primeras bases de esos codones son iguales. A este efecto se le conoce como wobbling. Cambios de Marco de Lectura. Durante la transcripción del mRNA de los genes gag y pol de retrovirus, un cambio de marco de lectura permite obtener del mismo mRNA a las proteínas Pol y Gag.

Sin embargo, en la mayoría de los genes, un cambio de marco de lectura conduce a una proteína no funcional. Estos cambios pueden darse por indeles (inserciones/deleciones) de un nucleótido o por splicing incorrecto. Ora pues, a lo que te truje... La síntesis proteica puede ser dividida en 5 etapas: 1.- Activación de aminoácidos. 2.- Iniciación 5.- Plegamiento y
modificación post-traduccional 4.- Terminación y reciclaje del ribosoma. 3.- Elongación. a) El grupo carboxilo del aminoácido es activado para la formación del enlace peptídico.
b) El aminoácido debe ser "ligado" de alguna manera a su codón correspondiente.

Ambas cosas se lograr al cargar al aa en el tRNA.
La aminoacil tRNA sintetasa reconoce al anticodón del tRNA y carga al aminoácido correspondiente. La subunidad 30s reconoce el sitio de inicio de la traducción ayudado por los Factores de Iniciación 1 y 3. El ribosoma tiene 3 sitios: A, P, E.
El aminoacil-tRNA se carga en el sitio A. El Met-tRNA es el primer tRNA que se carga.
En el proceso, interviene el FI 3. IF-1, IF-2 e IF-3 son liberados del complejo de iniciación
y se carga la subunidad grande del ribosoma (50s) para dar lugar a un ribosoma funcional 70S. La elongación involucra el apareamiendo de un nuevo tRNA en el siguiente codón, la formación del enlace peptídico entre los dos aminoácidos y finalmente la traslocación del ribosoma hacia el nuevo codón. Factores de liberación (RF 1, 2 y 3), contribuyen a la hidrólisis del enlace entre el último aminoácido y el tRNA, la liberación del péptido y del tRNA y la disociación del ribosoma 70S. Elongación Se une el segundo aminoacil-tRNA, que entra al sitio A.
La unión de este aminoacil (y los que siguen) es promovida por la hidrólisis de GTP. La parte catalítica del ribosoma, la que forma el enlace peptídico, es el rRNA 23S.
Hay una transferencia de grupo del segundo aminoacil anterior al siguiente, de modo que el primer tRNA queda libre. El ribosoma se mueve un codón hacia adelante usando energía de la hidrólisis de GTP.
EF-G está involucrado en este paso. Proofreading en el Ribosoma? La hidrólisis de GTP se lleva a cabo en una ventana de tiempo de milisegundos. Este intervalo provee el tiempo necesario para que el apareamiento de las bases entre el codón y anticodón sean verificados y que se elimine el aminoacil t-RNA si es incorrecto y se introduzca el tRNA adecuado. Terminación En bacterias, tres factores de terminación (o liberación) se conocen: RF-1, RF-2 y RF-3.
RF-1 reconoce al codon de termino e induce al rRNA 23s a formar un enlace peptídico con agua, en vez de con otro aminoácido.

Los RFs son homólogos estructurales de los tRNAs.
RF-1 reconoce a UAA y UAG
RF-2 reconoce a UAA y UGA

RF-3... la verdad es que no sabemos qué hace, pero se cree que ayuda a desensamblar al ribosoma.

La liberación del ribosoma permite que éste pueda ser utilizado en la síntesis de otro péptido. Cuánto cuesta hacer proteínas? La formación de cada aminoacil-tRNA requiere 2 ATPs (o GTPs).
Un ATP adicional se usa para corregir cuando la aminoacil transferasa se equivoca.
Un GTP se hidroliza durante la elongación
Un GTP se hidroliza durante la translocación

Así, por cada enlace peptídico se requieren al menos 4 ATPs.
Una proteína pequeña, de 120 aminoácidos, requiere 480 ATPS!!! Traducción y Transcripción. La Conectina tiene 34 350 aminoácidos. Échenle cuentas. En procariotas la transcripción de un gen está acoplada a la traducción del mismo. Incluso, pueden observarse múltiples ribosomas traduciendo al mismo mensajero. Iniciación La iniciación empieza con el reconocimiento de la secuencia Shine-Delgarno por el 16S rRNA, río arriba del inicio de la traducción. Modificaciones post-traduccionales. La mayoría de los eucariotes hace procesamiento post-traduccional, esto es, la adición de grupos funcionales específicos en regiones discretas de la proteína.

Éstas modificaciones pueden ser útiles para la regulación de la actividad de las proteínas, su migración hacia un organelo determinado, su degradación o su interacción con otros componentes celulares. Pérdida de péptidos señales. Las proteínas que requieren estar en organelos específicos, llegan a ellos gracias a la inclusión en su secuencia de péptidos señales.

Estas secuencias señalizadoras pueden estar en el N- o C-terminal y son eliminadas de la proteína por peptidasas específicas una vez que la proteína ha llegado a su organelo target. Pérdida de péptidos señales. Modificación de aa individuales. La fosforilación es uno de los ejemplos más evidentes. Se introducen cargas (de los grupos fosfato) a las proteínas y normalmente esto induce cambios conformacionales que alteran el estado activo/inactivo de la enzima. Glucosilación. La adición de azúcares normalmente permite a las proteínas ser discriminadas entre propias y extrañas, además de favorecer ciertos contactos entre receptores. Adición de Grupos Prostéticos. Algunas proteínas requieren grupos prostéticos para ser activas, la adición de estos grupos se realiza postraduccionalmente. Procesamiento Proteolítico. Algunas proteínas, como la insulina, deben ser fragmentadas por proteasas específicas para ser funcionales. Degradación de proteínas Todas las proteínas tienen una vida media.
A lo largo de la vida de las proteínas, sufren algunos daños, de manera que es indispensable cambiarlas constantemente. La maquinaria encargada de la degradación de las proteínas es una proteína con forma de barril: El proteosoma.

El proteosoma reconoce proteínas ubiquinadas y las degrada. ¡¡Final Feliz!! * Cómo se termina la replicación en células procariotas? * Menciona dos mecanismos de reparación de lesiones en el DNA (mutaciones puntuales, dímeros de timina, desaminaciones espontáneas...) * La cadena se sintetiza en la dirección 5' --> 3'. * Ambas requieren un templado, usualmente de DNA. * Ambas necesitan nucleótidos para elongar la cadena naciente. * En ambos casos, la reacción de adición de nucleótidos es un ataque nucleofílico del 3' -OH al 5' fosfato. Debido al "splicing diferencial" del estimado de >100,000 genes sólo se encontraron 25,000 en el genoma humano. Un gen una proteína? X Links de las presentaciones: Clase 1: http://bit.ly/XgUJEr
Clase 2: http://bit.ly/Clase2

Review Traducción: http://bit.ly/ribosoma
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