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blee tesis final .

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Victor Huamán Cárdenas

on 25 January 2013

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Transcript of blee tesis final .

PLANTEAMIENTO AGRADECIMIENTOS INDICE INTRODUCCIÓN OBJETIVOS INTRODUCCIÓN PLAN DE ANALISIS RESULTADOS MATERIALES
Y METODOS Antecedentes DEL PROBLEMA LIMA-PERÚ, 2013 AUTOR: Víctor Raúl Huamán Cárdenas
ASESOR: Lic. TM. Carlos Raúl Sevilla Andrade Tesis para optar el Título de Licenciado en Tecnología Médica UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
FACULTAD DE MEDICINA
E.A.P. DE TECNOLOGÍA MÉDICA.
AREA DE LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA DETECCIÓN FENOTÍPICA DE ENTEROBACTERIAS PRODUCTORAS DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO AISLADAS EN UROCULTIVOS DE GESTANTES. LIMA, PERU Este trabajo de investigación fue financiada con el apoyo del Fondo de Promoción de Trabajo de Tesis de Pregrado del VRI-UNMSM. AGRADECIMIENTOS Agradecimiento especial al Servicio de Microbiología del Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen por el apoyo constante de sus miembros, para la realización de esta tesis. Agradezco y dedico este trabajo a mi madre, por su paciencia y cariño incondicional; a mi asesor por su sabios consejos, a mis co-asesores por sus aportes y su apoyo en todo momento, a mis buenas amigas y amigos por sus palabras de aliento y apoyo. 1. INTRODUCCIÓN
1.1. MARCO TEÓRICO
1.2. ANTECEDENTES
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
3. OBJETIVOS
4. MATERIALES Y MÉTODOS
5. PLAN DE ANÁLISIS
6. RESULTADOS
7. DISCUSIÓN
8. CONCLUSIONES
9. BIBLIOGRAFIA INDICE Se refiere a toda invasión microbiana del aparato urinario que sobrepasa la capacidad de defensa del individuo afectado[1]. INFECCIÓN URINARIA El agente etiológico más frecuente de ITU en ambos sexos es la Escherichia coli (E. coli), responsable del 75% a 80% de casos; el 20% a 25% restante incluye microorganismos como:, Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, Klebsiella sp, Pseudomonas aeruginosa[2]. AGENTES ETIOLOGICOS La infección del tracto urinario (ITU), constituye ahora una de las infecciones más frecuentes durante el embarazo con una incidencia aproximada de 5% a un 10%[3]. INFECCIONES URINARIAS EN GESTANTES La detección de >10(5) ucf/ml en una muestra simple y única de orina por chorro medio es aceptada como una adecuada y práctica alternativa al criterio original, el cual menciona que debe obtenerse un recuento de colonias >10(5) ufc/ml en dos colectas limpias y consecutivas de orina[4].
Se debe valorar el riesgo del fármaco para el feto y la tasa de resistencia del centro hospitalario[5]. ANTIBIOTICOTERAPIA EN INFECCIONES DEL TRACO URINARIO EN GESTANTES 1. Sin efectos nocivos conocidos sobre el desarrollo embrionario:
Penicilinas
Aminopenicilinas
Carboxipenicilinas
Cefalosporinas
Monobactámicos

2. Con efectos nocivos, por lo tanto están estrictamente contraindicados:
Aminoglucósidos
Tetraciclinas
Acido nalidíxico MECANISMOS DE RESISTENCIA BACTERIANA Marco Teórico MÉTODOS DE DETECCIÓN FENOTÍPICA de BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO Tabla suplementaria 2A-S1 de CLSI M100-S21 (2011) Medio: Mueller Hinton
Puntos de corte según la CLSI 2011 ME TODO DE SCREENING Discos de CTX-CRO-CAZ-AZT O CEFEPIMA (FEP) a 25 mm de disco amoxicilina-ácido clavulánico. METODO CONFIRMATORIO DE JARLIER Tabla 1. Antimicrobianos usados para confirmación de BLEE en sistema VITEK® 2 Compact. METODO VITEK® 2 COMPACT EVIDENCIA DE BLEE EN GESTANTES
Detectar fenotípicamente enterobacterias productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) aisladas en urocultivos de gestantes. OBJETIVO GENERAL Identificar cepas productoras de BLEE en urocultivos de gestantes por método automatizado Vitek 2.

Confirmar cepas productoras de BLEE en urocultivos de gestantes por método estandarizado de Jarlier.

Describir la resistencia acompañante a los principales antibacterianos empleados en la terapéutica contra las infecciones urinarias en gestantes tanto en las cepas productoras de BLEE aisladas y las cepas no productoras de BLEE. OBJETIVOS ESPECIFICOS MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Para la tipificación molecular se estudiaron 2 subgrupos de genes del grupo blaCTX-M.
Los genes estudiados fueron CTX-M1 y CTX-M2. TIPIFICACIÓN MOLECULAR DE AISLADOS BLEE RECUPERADOS. Tabla 3. Protocolo blaCTX-M2 para elaboración de la Master Mix. Tabla 4. Protocolo amplificación blaCTX-M1 Tabla 5. Protocolo amplificación blaCTX-M2 Tabla 6. Primers utilizados en la amplificación por PCR de genes blaCTX-M ANÁLISIS ESTADÍSTICO:
Se evaluó el fenotipo de resistencia a los antimicrobianos calculando el porcentaje de susceptibilidad y resistencia, así como también el porcentaje de bacterias portadoras de alguno de los genes estudiados en la tipificación molecular. Los datos obtenidos fueron organizados y procesados con el programa informático EXCEL 2007.
 

ÉTICA:
Se siguieron los criterios y normas y normas éticas de la facultad de Medicina de la UNMSM.
Se garantizó la total confidencialidad de la identidad de las pacientes.
Los estudios microbiológicos para la investigación se realizaron a partir de la bacteria aislada. IDENTIFICACION BACTERIANA Y PERFIL DE RESISTENCIA Tabla 7. Resistencia antibiótica de enterobacterias en antibiograma de gestantes. DETECCIÓN FENOTÍPICA DE BETALACTAMASAS DE ESPECTRO EXTENDIDO. Correlación 100% entre método
Vitek 2 compact y método de Jarlier. Foto 1. Confirmación fenotípica por el método de Jarlier de aislamiento de Escherichia coli con producción de betalactamasa de espectro extendido. Aislado confirmado como no productor de BLEE Foto 3. Confirmación fenotípica por el método de Jarlier de aislamiento de Escherichia coli con producción de betalactamasa de espectro extendido. Foto 2. Confirmación fenotípica por el método de Jarlier de aislamiento de Escherichia coli con producción de betalactamasa de espectro extendido. Foto 4. Evaluación por método antibiograma manual de Kirby Bauer de sensibilidad a la fosfomicina y nitrofurantoina de los aislados BLEE positivos. DETECCIÓN DE RESISTENCIA ACOMPAÑANTE EN AISLADOS PRODUCTORES DE BLEE GRÁFICA 1. Patrón de suceptibilidad antimicrobiana en bacterias productoras de BLEE. Se recuperaron un total de 10 aislados productores de BLEE luego del almacenamiento a -20ºC.

Luego de la electroforesis en gel de agarosa se rebeló que 7 (70%) aislamientos portaban el gen blaCTX-M1 (foto 4) y 1(10%) tuvo el gen blaCTX-M2 (foto 5). Se observó también que el único aislamiento que poseía el gen CTX-M2 también portaba el gen CTX-M1.

Estos resultados sugieren que los otros 3 aislamientos poseen otros genes que codifican para un grupo de enzima BLEE que no fueron evaluados en este estudio. TIPIFICACIÓN MOLECULAR POR PCR DE MECANISMOS DE RESISTENCIA EN AISLADOS BLEE EN UROCULTIVO DE GESTANTES.

L: Ladder DNA 100 pb.
C- control negativo.
Carriles 1, 3, 4, 6, 8, 9 y 10 portadores del gen blaCTX-M1 (900 pb). L Foto 5. Productos de amplificación de PCR para el grupo de genes blaCTX-M1 L: Ladder DNA 100 pb.
C- control negativo.
Carril 3 portador del gen blaCTX-M2 (896 pb). Foto 6. Productos de amplificación de PCR para el grupo de genes blaCTX-M2 DISCUSIÓN En el presente estudio las bacterias gram negativas fueron predominantes, con la Escherichia coli como el uropatógeno más común (65.8%).

Otros estudios también reportan a Escherichia coli como el principal patógeno causante de ITU en población gestante con porcentajes de hallazgos que van del rango de 42% a 64% [9, 7, 10, 11, 12, 13, 14, 15] . En el único estudio nacional encontrado sobre sensibilidad antimicrobiana en urocultivo de gestantes, Motta[16] (2005) halló también como principal agente en las ITU a la E. coli en un 68%, lo cual indica que en nuestro medio la E. coli sigue siendo la bacteria más frecuentemente hallada en los urocultivo de gestante, manteniendo su frecuencia porcentual de hallazgo. Finalmente se observó el gran porcentaje de cepas productoras de BLEE que portaban el grupo de genes CTX-M1, este resultado es también se correlaciona con estudios que indican la gran prevalencia de este grupo de genes en América del Sur[19] y su emergencia en el mundo[20].

Este hallazgo es también de importancia epidemiológica en la distribución de clonas de bacterias que produjeron ITU en las gestantes en nuestro contexto de estudio, produciéndose probablemente una diseminación horizontal entre las gestantes. Tipificación molecular de aislados BLEE recuperados. CONCLUSIONES La prevalencia de aislados bacterianos productores de BLEE en aislados de urocultivos proveniente de gestantes en el Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen durante el periodo marzo – octubre del 2012 frente a todos los aislamientos que mostraron crecimiento para enterobacterias de urocultivos en gestantes fue del 38.8%.

Se mostraron altos niveles de resistencia de las cepas BLEE frente a las fluoroquinolona, la gentamicina y la combinación betalactámico/inhibidor de betalactamasa.
Se encontró buena susceptibilidad bacteriana frente a la nitrofurantoina y la fosfomicina, pudiendo convertirse en candidatos para el tratamiento empírico en ITU de gestantes.
 
Se halló una importante prevalencia del grupo de genes blaCTX-M1 en las bacterias recuperadas productoras de BLEE, evidenciando la distribución de este grupo de genes que codifican para BLEE en aislados bacterianos provenientes de urocultivo de gestantes. RECOMENDACIONES Realizar estudios multicéntricos con la misma temática en los principales hospitales materno – infantiles para evaluar la presencia de BLEE en estas pacientes gestantes.

Realizar estudios de epidemiología molecular a las cepas de gestantes para detectar la clonalidad de las bacterias, los genes implicados y su distribución en pacientes ambulatorias u hospitalizadas.

Realizar estudios más profundos sobre resistencia a fosfomicina en relación con aislados BLEE.

Realizar estudios in vivo en gestantes con infección urinaria con aislados BLEE que hayan sido tratadas con betalactámicos. 1. Evan B. Cohn and Anthony J. Schaeffer, “Urinary Tract Infections in Adults”. TheScientificWorldJOURNAL, 2004; vol. 4: 76-88.
2. Koneman - Diagnóstico Microbiológico 6ª edición Editorial Médica Panamericana 1691 pag. año 2006.
3. Connolly, AM. Thorp, J. Infections in 3. Urology: Urinary Tract Infections in Pregnancy. Urologic Clinics of North America. Volume 26. No4. November 1999.
4. Schnarr, J. Smaill, F., Asymptomatic bacteriuria and symptomatic urinary tract infections in pregnancy. European Journal of Clinical Investigation, 2008; Eur J Clin Invest. 38 Supl 2: 50–57.
5. Abarzúa CF, Zajer C, Donoso B, Belmar J, Riveros JP, González BP, Oyarzún E. Reevaluación de la sensibilidad antimicrobiana de patógenos urinarios en el embarazo. Rev Chil Obstet Ginecol. Pontificia Universidad Católica de Chile [en línea] 2002.
6. Meher Rizvi, Fatima Khan, Indu Shukla, Abida Malik, Shaheen. Rising Prevalence of Antimicrobial Resistance in UrinaryTract Infections During Pregnancy: Necessity for Exploring Newer Treatment Options.J LabPhysicians / Jul-Dec 98 2011 / Vol-3 / Issue-2.
7. Sabharwal ER. Antibiotic susceptibility patterns of uropathogens in obstetric patients. North Am J Med Sci 2012;4:316-9.
8. Yamane, Taro. 1967. Statistics: An Introductory Analysis, 2nd Ed. Pag.886, New York: Harper and Row.
9. Rizvi M, Khan F, Shukla I, Malik A, S. Rising prevalence of antimicrobial resistance in urinary tract infections during pregnancy : Necessity for exploring newer treatment options. JLab. Physicians 2011;3 :98-103.
10. Okonko IO, Ijandipe LA, IIusanya AO, Donbraye-Emmanuel OB, Ejembi J, Udeze AO, et al. Incidence of urinary tract infection (UTI) among pregnant women in Ibadan,south-western Nigeria. Afr J B iotech 2009;8:6649-57.
11. Pais P, Khurana R, George J. Urinary tract infections: A restrospective survey of causative organisms and antibiotics prescribed in a tertiary care setting. Indian J Pharmacol 2002;34:278-80
12. Llaca V, Fernández A. Enfermedades infecciosas, Obstetricia clinica, C. México, McGraw Hill , 4 ed, 2000:212.
13. Parveen SS, Reddy SV, Rao MV, Rao JR. Uropathogens and their drug susceptibility patterns among pregnant women in a teaching hospital. Ann Biol Res 2011; 2:516-21.
14. Casellas JM. Resistencia a los antibacterianos en América Latina: consecuencias para la infectología. Rev Panam Salud Publica. 2011;30(6):519–28
15. Jarlier V, Nicolas M, Fournier G y Philippon A. Extended broa-d-s--pectrum beta lactamases conferring transferable resistance to newer beta lactam agents in Enterobacteriaceae. Rev Infec Dis 1988;10:867-878.
16. Motta Jimenez M. Sensibilidad antibiótica y características clínicas asociadas de las bacterias causantes de ITU en gestantes. HNDAC. Enero - marzo 2005. [tesis para optar el título profesional de especialista en Gineco Obstetricia.]. Lima. Universidad Nacional Mayor de San Marcos; 2005.
17. M. S. Hernández, et al. Actividad in vitro de fosfomicina frente a enterobacterias de origen urinario productoras de betalactamasas de espectro extendido. Rev Esp Quimioter 2009;22(1):25-29.
18. De Cueto M, et al. Actividad de fosfomicina sobre cepas de Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae productoras de betalactamasas de espectro extendido. Enferm Infecc Microbiol Clin 2006;24(10):613-6
19. 39.Casellas José María. Resistencia a los antibacterianos en América Latina: consecuencias para la infectología. Rev Panam Salud Publica [serial on the Internet]. 2011 Dec [cited 2012 Nov 25] ; 30(6): 519-528. Available from: http://www.scielosp.org/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1020-49892011001200004&lng=en.
20. Rodríguez-Baño J, Navarro M D, Romero L, Muniain M A, de Cueto M, Ríos M J, et al. Bacteremia due to extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli in the CTX-M era: a new clinical challenge. Clin Infect Dis 2006; 43 (11): 1407-14.. BIBLIOGRAFÍA BIBLIOGRAFÍA GRACIAS POR SU ATENCION Calcular la prevalencia de enterobacterias con producción de BLEE en urocultivo de gestantes atendidas durante el periodo de enero a octubre del 2012 en el Hospital Nacional Guillermo Almenara Irigoyen.

Tipificar molecularmente por PCR los aislados BLEE en urocultivo de gestantes. OBJETIVOS ESPECIFICOS Tabla 2. Protocolo blaCTX-M1 para elaboración de la Master Mix. Trimetoprima/ Sulfametoxazol: está contraindicado en el 1º Trimestre y después de las 28 semanas.

Nitrofurantoína y Sulfamidas: contraindicados en el 3º Trimestre Cloranfenicol: contraindicado antes de las 12 semanas y después de 28 semanas[5]. Puntos de corte de FOSFOMICINA que correlacionan con
CIM: S <=32 μg/ml- R >=64 μg/ml:
FOSFOMICINA 50 ug: S>=15 mm- R<=12mm
FOSFOMICINA 200 ug: S>=17 mm- R<=15mm Pasteran y cols. 21st European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases and the 27th International Congress of Chemotherapy, 7-10 Mayo- Milan 2011. NITROFURANTOINA (300ug.) PUNTOS DE CORTE CLSI 2011

S: >17 mm
I: 15-16 mm
R: <14 mm Hernando Avendaño L. Nefrología Clínica. 3a ed. Madrid, España: Médica Panamericana S.A.; 2008.
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