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Quantification of two viral transcripts by real time PCR to

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by

Diana Lopes

on 19 May 2014

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Transcript of Quantification of two viral transcripts by real time PCR to

Quantification of two viral transcripts by real time PCR to investigate human herpesvirus type 6 active infection
Objetivos
Métodos
Resultados
Discussão
Realizado por:
Bárbara Costa e Diana Lopes

Imunologia
Professora Anabela Cordeiro
Introdução
Herpesviridae
Beta -Herpesviredae
Rosolovirus
Género
HHV - 6A

HHV - 6B
Família
Sub-família
HHV - 6 estabelece latência após a primeira infeção, que acontece cedo durante a infância e está associado a erupções repentinas. Mais tarde pode reativar, normalmente assintomaticamente, à exceção de pacientes que receberam um transplante de células estaminais hemotopoiéticas (HSCT):
- Atraso de neutrófilos
- Enxerto de Plaquetas
- Erupções Cutâneas
- Febre
- Pneumonite ou Encefalite

Mais de 75 % dos pacientes podem desenvolver infeção por HHV - 6.


Este virus tem a capacidade de se integrar no cromossoma humano, na proximidade dos telómeros, sendo que cromossomicamente integrado ( CI - HHV-6 ) esta presente em cerca de 1% da população, onde pelo menos uma cópia do virus está em todos as células nucleadas.
CI - HHV-6 não tem sido relacionado a nenhum sintoma, porém está associado a elevadas cargas de DNA em PMBC's.
CI - HHV-6 pode ser detetado em amostras não celulares, podendo levar a um diagnostico de infeção ativa. Porém em algumas condições é necessário a pesquisa de novos indicadores de multiplicação viral, como o
mRNA viral
, e é exatamente esse o indicador que este estudo utiliza.

Infeções in Vitro
Cultura de células MT4 a 37ºC em 5% de CO2, em meio RPMI-1640, suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, Penicilina 103 U/mL, colistina 2500 U/mL e Estreptomicina 10 mg/mL.
Infeção das células MT4 com HHV-6B HST estirpe e recolha para análise passado 0, 2, 6 e 24 horas e 8 dias após infecção (controlo positivo).
Purificação de DNA e RNA total usando o Kit DNeasy de sangue e tecidos e o Mini Kit RNeasy. Remoção do DNA residual com RNase isento de Dnase.
Kit DNeasy Blood and Tissue
Mini Kit RNeasy
Amostra de Pacientes
60 amostras de sangue coletadas com EDTA de 16 pacientes submetidos a HSCT, após uma semana de infeção com HHV-6 ( 1 carga de DNA> 1000 cópias/mL de sangue total ou 2 cargas de DNA positivo consecutivo entre 100 e 1000 cópias/mL
Lise de eritrócitos a partir de 1 mL de sangue total e armazenamento dos leucócitos em tampão RLT a -70ºC
Purificação de DNA e RNA total a partir de lisados celulares, utilizando o Kit DNeasy de sangue e tecidos e o Mini Kit RNeasy. O DNA residual foi removido com Rnase isento de Dnase.
Ensaios Moleculares
Quantificação de DNA viral
Quantificação de mRNA U90 e U100
A quantificação de DNA viral de HVV-6 foi feita por método descrito anteriormente:
A carga de DNA de células MT4 infetadas com HHV-6 foram normalizadas para o número de células quantificadas de Albumina por qPCR
A carga viral das amostras clínicas foram expressas pelo nº de cópias em ml de sangue total




RT - qPCR foi realizado usando o SYBR® One Step PrimeScript TMRT - PCR Kit numa mistura de reação de 25 microL contendo 5 micrL de extrato de RNA , 12,5 micro L de 2 × buffer, 0,4 microM de cada primer, 0,1 microM de sonda , 0,08 microg/MicroL do gene T4 da proteina 32 , 1,25 U de Takara ExTaq HS ( 2,5 U / microl) , 1,25 L de PrimeScript RT enzima Mix II (2,5 U / microl ) .
O gene GAPDH humano foi usado como controlo endogeno.
O programa de amplificação consistiu em :
Transcrição reversa a 42ºC durante 5 min , 94º C durante 10 s
45 ciclos de 94ºC durante 5 s , 57ªC ( U90 e GAPDH ) ou 59ºC ( U100 ) durante 20 s , 72ºC durante 15s.
Dois padrões de cDNA foram gerados por clonagem de U90 e U100 em PCR ® II TOPO de sistema vector de clonagem. Um padrão de RNA, também foi produzido a partir do plasmídeo U100 por transcrição in vitro utilizando o Kit SP6 MAXIscript ® , após a amplificação com um iniciador directo U100P1F modificado com a sequência do promotor SP6 .
U90 e U100 foram quantificados com base nas curvas padrão geradas a partir de diluições de cada um dos plasmídeos . Os resultados foram expressos como o número de cópias de mRNA / ml de sangue total (das amostras clinicas) ou normalizados para o número de células infetadas in Vitro.
ROTORGENE 6000
Desenvolvimento de duas técnicas de RT - qPCR para quantificar a expressão de DNA viral e de HHV-6 no etapa inicial (U90) e final (U100) do ciclo de multiplicação do vírus.
RT-qPCR usado para detetar HHV-6B
Infeção in Vitro
Amostras de pacientes submetidos a HSCT
RT-PCR consiste numa reação da transcriptase reversa, seguida de uma reação em cadeia da polimerase . Utitiliza como molde o RNA de cadeia simples, a partir do qual a enzima RT sintetiza uma cadeia de DNA complementar (cDNA). Ao cDNA aplica-se a técnica de PCR.
Em tempo real é o mesmo que dizer PCR quantitativo, qPCR, e nesta técnica além de se ampliar DNA também se quantifica .
A PCR em tempo real realiza quantificação de maneira precisa e de maior reprodutibilidade porque determina valores durante a fase exponencial da reação. O ponto que deteta o ciclo na qual a reação atinge o limiar da fase exponencial é denominado de Cycle Thershould (CT). Este ponto permite a quantificação exata e reprodutível baseado na fluorescência.
Os compostos fluorescentes mais utilizados são o SYBR Green ® e TaqMan®, sendo que é o primeiro que é utlizado neste estudo.
O SYBR Green ® atua ligando-se entre a cadeia dupla de DNA. Este composto é de baixo custo, de fácil uso e sensivel, porém por vezes também se liga aos dímeros de iniciação e a outros produtos inespecíficos, podendo superestimar a concentração do fragmento alvo.
qPCR
Validação do RT-qPCR
Marcadores de infeção viral:
- Quantificação de DNA no plasma

- Quantificação de transcritos (cópias)
virais em diferentes fases da multiplicação do vírus
U90 e U100 são produzidos em grande escala em casos de infeção por HHV-6
U90 representa o início da multiplicação viral e U100 representa a fase tardia da multiplicação
Ensaio sensível (LD 5 cópias/reação) e com boa reprodutibilidade (ordem dos 10^4)
Foram ainda comparados dois padrões de cDNA (plasmídeo) com RNA (transcrito
in vitro
)
Verificou-se que o cDNA é mais eficaz na quantificação do que o RNA, uma vez que este último apresentou grandes variações de valores para concentrações mais baixas.
Há ainda uma relação linear entre U90 mRNA, U100 mRNA e DNA viral durante o decurso da infeção
in vitro
; Já
in vivo
isso não acontece.
Turma 6
O PCR foi validado uma vez que os controlos positivos e as amostras dos pacientes deram negativo para a presença de contaminações de DNA, o que nos indica que o RNA foi corretamente extraído.


O limite de deteção no RT-qPCR foi de 5 cópias/reação;
O limite de quantificação no sangue total foi de 50 cópias/mL
A diferença entre os valores das cópias do fragmento U100 de RNA e do cDNA foi de 0.0+/-0.53 log(cópias/reação).
No entanto, para concentrações entre 5 e 50 cópias por reação a reprodutibilidade do RNA é baixa em relação ao cDNA.
Cinética da replicação da infeção in vitro
Os pacientes foram escolhidos aleatoriamente e nenhum deles foi submetido a tratamento antiviral.
A quantidade de RNA é muito inferior à quantidade de DNA. O significado clínico desta RNAemia terá de ser estudado futuramente.
Full transcript