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Fertilización In Vitro en bovinos

Aplicaciones y técnicas para Fertilización In Vitro (FIV) en bovinos según protocolo de Facultad de Veterinaria Uruguay
by

Yael Filipiak

on 27 October 2016

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Transcript of Fertilización In Vitro en bovinos

Se requiere de un laboratorio montado con equipos costosos y personal capacitado
Heladeras
Autoclave
Horno
Destilador de agua
Ultrapurificador de agua
Balanza de precisión (pesa mg)
Micropipetas automáticas de diferentes calibres
Baño María
Platinas calientes
Mechero
Lupas estereoscópicas y microscopios
Centrífuga
Termo de nitrógeno
Cabina de flujo laminar
Estufa de cultivo con conexión a CO2
Congeladora automática de embriones
Ovocito Primario  Profase de la Meiosis I, Diploteno (pausa = dictioteno)

Maduración citoplasmática y nuclear

Ovocito Secundario  Metafase de la Meiosis II

Fertilización

Completa la Meiosis
Dra. Yael Filipiak
Fertilización In Vitro en Bovinos (FIV)
Diversas especies
Historia de la FIV
Bovinos
Concepción y Partos
Historia de la FIV
En Uruguay: primeros terneros obtenidos
por FIV en Latinoamérica
1989
FECUNDACIÓN DE LOS OVOCITOS
CULTIVO DE LOS OVOCITOS FECUNDADOS
Evaluación y clasificación
de los COC
A
B
C
D
Folículo
primario
Folículo
Secundario
Folículo
Terciario
Folículo
de Graaf
Túnica
albugínea
Epitelio
germinal
Corpus
albicans
Folículo
atrésico
Células
intersticiales
Hilio
Cuerpo
lúteo
Folículo
primordial
C
1
3
2
1
2
3
4
Caja de petri numerada con gotas de semen,
cubiertas con aceite mineral
(gotas de 100 µ)
Incubación 5 h
5% CO2
38 ºC
Maduración de los COC
Fecundación
Fecundación
ICSI
Inyección intracitoplasmática de espermatozoides
(intracytoplasmic sperm injection)
Área de Biotecnología de la Reproducción Animal
Facultad de Veterinaria
Fertrilización In Vitro en Bovinos
Dra. Yael Filipiak
Dra. Clara Larocca
FERTILIZACIÓN IN VITRO EN BOVINOS
Aspiración de los COC
Ovocito maduro (secundario)
Ovocitos inmaduros
Fertilización In Vitro
o inseminación
Enzimas contenidas en el acrosoma
Ornitina-decarboxilasa
Fosfolipasa A
Fosfolipasa C
L-Fucosidasa
-Galactosidasa
-Glucoronidasa
Hialuronidasa
Peptil-peptidasa
-N-acetilhexosaminidasa
Acrosina
Arilaminidasa
Colagenasa
Proacrosina
Neuroaminidasa
Estearasas
Fosfatasas
Pronúcleos masculino y femenino
Medio de aspiración y lavado
m-PBS: Buffer Fosfato Salino modificado
Consiste en:
D-PBS (+) – solución stock
Penicilina – Estreptomicina
SFb (suero fetal bovino)
COMPOSICIÓN DEL MEDIO PBS:
NaCl 8,00 g/l
KCl 0,20 g/l
KH2PO4 0,20 g/l
Na2HPO4 1,15 g/l
MgCl26H2O 0,10 g/l
CaCl2 0,10 g/l
De animales vivos: OPU (ovum pick up)
Maduración del óvulo
Preparación citoplasmática
Preparación nuclear
Retoma la meiosis. Desde Profase I, diploteno (estado de latencia, Dictioteno), se detiene nuevamente en la Metafase II.
Formación del primer cuerpo polar
Expansión de las células del cúmulus
Estados de desarrollo de los embriones
Embriones en diferentes estados de desarrollo. Se evalúan
El Laboratorio
Búsqueda y obtención de los COC
Capacitación y lavado del semen
La capacitación permite:
Adquirir hipermotilidad para avanzar por el mucus oviductal
Penetrar el cúmulus
Prepararse para la reacción acrosómica
Bioquímica de la capacitación:
Aumento del pH
Aumento de la permeabilidad al calcio
Fusión de membranas
Interacciones con glucosaminoglicanos
Cambio en la relación colesterol/fosfolíidos
La Fertilización
In Vitro
es una biotecnología reproductiva de alta complejidad, mediante la cual podemos obtener embriones viables en condiciones de laboratorio
(In Vitro),
que pueden ser implantados en el útero de hembras receptoras con sus ciclos previamente sincronizados, que son capaces de llevar a termino la gestación.
Metodología
Origen de los COC (complejos ovocito cúmulus)
De hembras vivas
OPU, aspiración con aguja guiada por ultrasonografía
Aspiración con aguja y endoscopía
Laparotomía (usada sólo en casos especiales)
Preparación del semen – Lavado y capacitación
Platina caliente (35 ºC) y Baño María (35 ºC)
Descongelación de la pajuela de semen:
10 seg. a temp. ambiente
30 seg. a baño María (35 ºC)
Colocar el semen en tubo de centrífuga (gota en portaobjetos -sobre la platina- para evaluación)
Se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
Centrifugar a 500 G (2000 rpm, dependiendo del diámetro de la centrífuga), 5 min.
Aspirar sobrenadante
Nuevamente se agregan 6 ml de sol BO de lavado de semen
Centrifugar a 500 G, 5 min.
Aspirar sobrenadante
Diluir el pellet en sol. BO de dilución de semen
Vol (i) x [ i ] = Vol (f)
[ f ]
Medio de cultivo (CR1aa)
cubierto por aceite mineral
Los ovocitos fecundados se incuban para desarrollo en medio CR1aa, en incubadora
De animales muertos: material de matadero o hembras recién muertas
Aspiración del líquido folicular (folículos de 2 a 8 mm de diámetro)
Desmenuzamiento del ovario (slicing)

Origen de los COC (complejos ovocito cúmulus)
Clasificación de los COC

Calidad Características a evaluar

A Bueno: Completamente rodeado por más de 3 capas de células del cúmulus y citoplasma homogéneo

B Regular: Rodeado parcialmente por células del cúmulus

C Malo: Desnudo y citoplasma irregular

D Degenerado: Rodeado por fibrina (con aspecto de tela de araña)

(Liebfried L and First N L, 1979; Sato E y col, 1990)
A
B
C
D
MEIOSIS 1
Profase,
Metafase, Anafase, Telofase
MEIOSIS 2
Profase,
Metafase
, Anafase, Telofase
PROFASE 1
Leptoteno, Zigoteno, Paquiteno,
Diploteno,
Diacinesis
Qué espero aprender?
Desarrollo del tema
Concepto de Fertilización in vitro
Historia
Metodología para la obtención y maduración de ovocitos bovinos
Metodologías para la capacitación de semen in vitro
Fertilización
Cultivo de desarrollo
Evaluación del clivaje y desarrollo embrionario en FIV

En el mundo se producen más de 500.000 embriones bovinos anuales provenientes de FIV
Objetivo principal - cómo se logra?
Avance genético
Aumento de la presión de selección
Difusión de la mejora genética
Reducción del intervalo intergeneracional
Progreso genético =
[Heredabilidad] x [Diferencial de selección]
[Intervalo entre generaciones]
Una síntesis
Cómo se producen los embriones
Obtención de los COC
Clasificación de los COC
Maduración
in vitro
Fertilización
in vitro
Desarrollo
in vitro
Evaluación de clivaje (48hs)
Evaluación de embriones (7 días)
Qué se necesita?
COMPONENTES DEL SISTEMA OPU

Escáner ultrasónico con trasductor o sonda de ultrasonido
bomba de aspiración
sistema de guía + aguja
TRANSDUCTOR

En veterinaria se trabaja con frecuencias desde 2 a 10 MHz, y principalmente los transductores son de 3.5, de 5 o de 7,5 MHz. A más alta frecuencia mejor resolución, pero menor penetración y viceversa.
El transductor de 5 MHz permite visualizar folículos de 4mm y CL.
Transductores de 7.5 MHz permiten visualizar folículos de 2mm y analizar el CL.
La aspiración
La técnica
Adaptado de Palma, 2008
f: folículos
LP: linea de punción
En qué consiste la maduración del óvulo
Maduración in vitro
Ovocito primario:
profase de Meiosis I en estado de diploteno (arresto meiótico).
Inhibidor de la maduración del ovocito (OMI) -> es suprimido por la ola preovulatoria de LH
Estímulo adecuado de FSH y LH
Crecimiento
Preparación citoplasmática y nuclear
Expansión de las células del cúmulus
OVOCITOS MADUROS
Expansión de células del cúmulus
1º cuerpo polar
Metafase II
In vivo e in vitro...
Cómo se logra la capacitación?
In vivo
se logra por:
Remoción de factores decapacitantes
Interacción con factores capacitantes en vías femeninas
Expulsión del colesterol de la membrana del espermatozoide
In vitro:
Heparina
Abúmina (BSA)
Cafeína o adrenalina -> incrementa el efecto de la penetración
Medios de lavado y capacitación
Método BO
COMPOSICIÓN DE SOLUCIÓN BÁSICA BO (Bracket and Oliphant, 1975):

Solución A
NaCl 2,1546 g
KCl 0,0987 g
Na2PO42H2O 0,0420 g
MgCl26H2O 0,03485 g
CaCl22H2O 0,1085 g
Rojo Fenol (0,5%) 50 µl
Agua ultrapura hasta 500 ml

Solución B
NaHCO3 1,2937 g
Rojo Fenol 20 µl
Agua ultrapura hasta 100 ml
La solución B se burbujea con CO2
Solución A 76 ml
Piruvato de Sodio 0,01375 g
Penicilina 10.000 UI
Estreptomicina 10 mg
Solución B 24 ml
De esta solución se preparan los medios de:
lavado de semen -> BO + Cafeína + Heparina
lavado de ovocitos -> BO + BSA (10 mg/ml)
dilución de semen -> BO + BSA (20 mg/ml)
Desde la inseminación
Desarrollo cronológico de los embriones
CALIDAD
La calidad se evalúa con códigos del 1 al 4 basados en la integridad morfológica de los embriones
Código 1
EXCELENTE O BUENO
Simétrico y esférico

Blastómeros uniformes en tamaño, color, densidad

Consistente con el día de desarrollo

Irregularidades menores e inferiores a 85% del material celular

Zona pelúcida esférica sin concavidades o zonas rotas o debilitadas
Código 2
REGULAR
Irregularidades moderadas en la masa celular o en tamaño, color o densidad.

Un mínimo de un 50% de material celular intacto
Código 3
POBRE
Mayores irregularidades en masa embrionaria, tamaño, color o densidad.

Un mínimo de 25% del material celular debe estar intacto
Código 4
MUERTO O DEGENERADO
Infértiles (ovocitos)

Embriones que no dividieron

Embriones que dividieron y degeneraron
Qué aprendimos?
Conclusiones
La FIV es una biotecnología de alta complejidad que permite obtener embriones en condiciones de laboratorio
Su principal objetivo es el progreso genético acelerado
Es necesario contar con un laboratorio equipado y personal capacitado
Consta de una serie de pasos que intentan imitar lo que sucede naturalmente en el organismo de la hembra
Se pueden obtener gran cantidad de embriones a través de esta técnica
?
Full transcript