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Defensa de tesis

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Transcript of Defensa de tesis

CLONACIÓN, CARACTERIZACIÓN Y EXPRESIÓN DE GENES CODIFICANTES PARA CELULASAS
Director de Tesis:

M.C. Tania Siqueiros Cendón

Asesor de tesis:
Dr. Quintín Rascón Cruz

Presenta:
Sandra Denisse Chánez Paredes

Suministro más abundante
en la naturaleza.

Sticklen y cols., 2008
Ward y cols., 2011
Celulosa
Estructura de la celulosa
Celulasas
Endoglucanasas
Beta- Glucosidasas
Exoglucanasas
Ten y cols., 2004
Tipos de celulasas
Ten y cols., 2004
Antecedentes generales
Antecedentes particulares
Se pueden clonar genes codificantes
para celulasas y expresarlos
en E. coli, caracterizando las clonas obtenidas con enzimas de restricción y comprobando la expresión del gen con ensayos de degradación de celulosa.
La celulosa constituye el suministro más abundante en la naturaleza, su hidrólisis se lleva a cabo mediante enzimas celulolíticas. Las celulasas son utilizadas en una amplia variedad de industrias, como lo son la alimentaria, textil, de detergentes, de cervecería, del papel y producción de bioetanol. Los avances tecnológicos han permitido la producción sintética de estas enzimas, sin embargo, a un precio muy elevado. Clonar genes codificantes para celulasas en cepas de E. coli ofrece la ventaja de optimizar la actividad celulolítica en el medio.
Justificación
Clonar, caracterizar y expresar genes codificantes para celulasas en cepas de
E. coli.

Objetivo general
1 Clonar genes que codifiquen para genes celulasas en E. coli.


2 Caracterizar las clonas obtenidas de los genes.


3 Comprobar la expresión de los genes codificantes para celulasas con ensayos de degradación de celulosa.
Objetivos particulares
Métodos
Extracción de DNA cromosomal
Ligación del producto de PCR al vector pET32
Ensayos de degradación de E. coli transformada
Siembra de la cepa con actividad celulolítica B. subtilis
PCR del gen
celulolítico
Palacios y cols., 2009; Deliang y cols., 2010
Comprobación de la expresión de los genes celulolíticos con ensayos de degradación de celulosa.
Martínez y cols., 2012
Por su atención
GRACIAS
Monómeros de glucosa unidos por enlaces tipo Beta- 1,4- glucosídicos.
Diagrama de los tres tipos de reacciones que catalizan las celulasas.
Contenido
Introducción
Antecedentes
Hipótesis
Justificación
Objetivos
Materiales y métodos
Resultados
Conclusiones
Perspectivas y recomendaciones

Material biológico
Microorganismo con actividad celulolítica.
Bacillus subtilis ATCC 11774

Cepa E. coli DH5 alfa

Cepa E. coli Mach1 T1

Cepa Sol 2-5 (Martínez, 2012)

Cepa Es 1-6 (Martínez, 2012)

Plásmido pET32a
2012
Caracterización de las clonas con enzimas de restricción
Transformación de células competentes de E. coli
Primers
Cel-NcoI- F
Cel-HindIII-R
Introducción
Antecedentes
Hipótesis
Objetivos
Materiales y métodos
Resultados
Justificación
Sinodales:
Dra. Blanca Rivera Chavira
Dr. Sigifredo Arévalo Gallegos
Dra. Laila Nayzzel Muñoz Castellanos

Producción de bioetanol
Industria de detergentes
Industria
cervecera
Industria
del papel
Aplicaciones de las celulasas
Industria
textil
Industria
alimentaria
Esta amplia gama de aplicaciones demuestra el enorme valor comercial de las celulasas en la industria biotecnológica.
Material sintético
Material sintético
Material sintético
Bollet y cols., 2006
Cuantificación
de DNA
Hoinsington y cols., 1994.
Extracción de DNA genómico de
B. subtilis
Amplificación por PCR del gen celulasa
de B. subtilis
Diferenciación de productos de PCR con enzimas de restricción
CN

CP

PUC19

CelD
Transformación de E. coli MACH1 T1 con el gen Cellulase D de B. subtilis
CN

CP

PUC19

CelC
Transformación de E. coli DH5 alfa con gen sintético CelC
CN

CP

PUC19

Cel9A

mfc
Transformación de E. coli DH5 alfa con genes sintéticos Cel9A y mfc
Caracterización con enzima BamHI
Caracterización con enzimas XbaI y SphI
Caracterización de clonas del gen sintético CelC con enzimas de restricción
Caracterización del gen sintético mfc con enzimas de restricción
Caracterización de clonas del gen Cel9A sintético con enzimas de restricción
MPM
Caracterización del gen CelD de B. subtilis con enzimas de restricción
Caracterización con enzimas NcoI y HindIII
Caracterización con enzima XbaI
Caracterización con enzimas XbaI y SmaI
Caracterización con enzima KpnI
Caracterización con enzimas KpnI y SmaI
Prueba de actividad celulasa extracelular
Gen CelD de B. subtilis
Gen CelD y Gen mfc celulase
Prueba de actividad celulasa extracelular
Conclusiones
Las pruebas moleculares y el estudio in silico del mapa de restricción del gen celulasa aislado de B. subtilis permitió llegar a la identificación del gen CelD.

La clonación y caracterización de los genes sintéticos CelC, mfc celulase y Cel9A se llevó a cabo con éxito y, a pesar de que las clonas del gen CelD de B. subtilis no mostraron el patrón esperado, en una prueba de degradación de celulasa demuestra claramente su actividad.

Del gen CelD las clonas D3, D4 y D5 mostraron la mayor actividad celulolítica. Las clonas C1, C5 y C6 fueron las que presentaron mayor halo de degradación de celulosa del gen cel9A, mientras que para los genes Cel9A y mfc celulase fueron las clonas 91, 93, 96 y m1, m4, m6, respectivamente.
Inducción de expresión de proteínas y su análisis por SDS- PAGE.
Marín y cols., 2007
Marín y cols., 2007
Producto esperado
1500- 2589 pb
Plásmido pET32CelD
Plásmido sintético pJ401CelC
Plásmido sintético pJ401Cel9A
Plásmido sintético pJ404mfc
Seminario de defensa de tesis
Digestión de producto de PCR y plásmido pET32 con enzimas de restricción
NcoI
HindIII
Digestión con enzima EcoRI
Fragmento esperado
5740 pb
Fragmentos esperados
3862 pb
1842 pb
Fragmento esperado
5205 pb
Fragmentos esperados
3912 pb
1257 pb
Fragmento esperado
5261 pb
Fragmentos esperados
4105 pb
1156 pb
Fragmento esperado 1527 pb
5632 pb
5170 pb
3976 pb
1487 pb
3972 pb
1723 pb
5194 pb
1283 pb
4130 pb
PCR primers Cel
PCR primers bact16S
MPM
Gen CelD
CN
CP
MPM
DNA
MPM
Clona 3
Clona 6
Clona 8
Clona 9
Clona 10
Clona 14
Clona 16
CN
MPM
Clona 1
Clona 2
Clona 3
Clona 4
Clona 5
Clona 6
Clona 7
CN
MPM
Clona 1
Clona 2
Clona 3
Clona 4
Clona 5
Clona 6
Clona 7
CN
MPM
Clona 1
Clona 2
Clona 3
Clona 4
Clona 5
Clona 6
Clona 7
CN
MPM
Clona 1
Clona 2
Clona 3
Clona 4
Clona 5
Clona 6
Clona 7
CN
MPM
Clona 1
Clona 2
Clona 3
Clona 4
Clona 5
Clona 6
Clona 7
CN
MPM
Clona 1
Clona 2
Clona 3
Clona 4
Clona 5
Clona 6
Clona 7
CN
Caracterización de producto de PCR del gen celulasa de B. subtilis
MPM
PCR/EcoRI
PCR/HindIII
Eficiencia de transformación 0.3375X10 transformantes por ug de DNA.
6
Eficiencia de transformación 1.062 X 10 transformantes por ug de DNA.
6
Eficiencia de transformación 0.1350 X 10 transformantes por ug de DNA.
6
Gen codificante para una celulasa de B. subtilis
NcoI
HindIII
Caja A

Caja B

Caja C

Caja D
UFC

0

Incontables

25

21
Caja A

Caja B

Caja C

Caja D
UFC

0

Incontables

118

+50
Caja A

Caja B

Caja C

Caja D

Caja E
UFC

0

Incontables

10

9

8
Caracterización de clonas del gen sintético CelC con enzimas de restricción
Caracterización de clonas del gen Cel9A con enzimas de restricción
Caracterización de clonas del gen mfc con enzimas de restricción
23130 pb
1689 pb
1577 pb
1121 pb
450 pb
1274 pb
375 pb
1616 pb
3221 pb
Antecedentes generales
Molecular cloning and expression of a synthetic gene encoding a B-glucosidase of Aspergillus niger in the methylotropic yeast Pichia pastoris.
Production and characterization of Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in Pichia pastoris.
Effect of codon optimization on the expression of Trichoderma reesei endoglucanase 1 in Pichia pastoris.
Didier y cols., 2010
Lindenmuth y McDonald, 2011
Akcapinar y cols., 2011
Ampullaria crossean
Neocallimastix sp.
Phanerochaete chrysosporium
Prueba de actividad celulasa extracelular
Gen CelC y Gen Cel9A
Análisis de proteínas por SDS- PAGE
M9 + CMC + Kan + IPTG
M9 + CMC + Amp + IPTG
Prueba de actividad celulasa extracelular
Gen CelD y mfc celulase
Gen CelC y gen Cel9A
Prueba de actividad celulasas extracelular
M9 + Cel + Amp + IPTG
M9 + Cel + Amp + IPTG
crist.
crist.
MPM
CelD ind
CelD no ind
CelC ind
CelC no ind
Cel9A ind
Cel9A no ind
mfc ind
mfc no ind
CellulozymeXB
1 Clonar genes que codifiquen para genes celulasas en E. coli.

2 Caracterizar las clonas obtenidas de los genes.

3 Comprobar la expresión de los genes codificantes para celulasas con ensayos de degradación de celulosa.
Objetivos particulares
CelD 55
CelC 88
Cel9A 63
mfc 44
D3, D4, D5
0.8 cm

M1, M4, M6
0.6 cm
C1, C5, C6
0.6 cm

91, 93, 96
0.6 cm
Sol 2-5
0.7 cm
Es 1-6
1.1 cm
Sol 2-5
0.7 cm
Es 1-6
1.1 cm
•La clonación de genes celulolíticos en cepas de E. coli permitió tener resultados de actividad celulolítica en tiempos de incubación inferiores, en comparación con cepas nativas celulolíticas aisladas por Martínez (2012).

•El uso de genes sintéticos facilitó la tarea de clonación, implicando un ahorro de tiempo y dinero, en comparación con la clonación del gen CelD aislado a partir de una cepa de B. subtilis.
Conclusiones
Perspectivas y recomendaciones
1.
Caracterizar las clonas del gen CelD por secuenciación.

2.
Demostrar la actividad enzimática de los genes que codifican para celulasas mediante una técnica electroforética de zimograma.

3.
Determinar las condiciones óptimas de inducción para la expresión de proteínas de las clonas, probando diferentes condiciones de temperatura, concentración de IPTG y tiempo de inducción.
Endoglucanasa
Endoglucanasa
Endo/Exo-glucanasa y xilanasa
kDa
Gen
Hoinsington y cols., 1994.
Extracción de DNA
plasmídico
Invitrogen, 2006
Invitrogen, 2006
Invitrogen, 2006
Sol 1-2
Sol 2-4
Sol 2-5
Es 1-6
Es 2-8
Es 2-9
P1-12
1 Clonar genes que codifiquen para genes celulasas en E. coli.


2 Caracterizar las clonas obtenidas de los genes.


3 Comprobar la expresión de los genes codificantes para celulasas con ensayos de degradación de celulosa.
Objetivos particulares
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