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DNA-Cloning

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by

Alisa Jost

on 13 December 2013

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Transcript of DNA-Cloning

Cloning- Project B1
Backbone:
pc841-pMeCP2Y
Gene of interest: MBD
Fluoreszenz: YFP
Größe 4972nt
Kanamycin-Resistenz


in silico cloning
Transformation und
Transfektion

Insert:
pc1054-pENmRFPCNAL2
Fluoreszenz: mRFP
Größe 5997nt

1)
Backbone
YFP wird rausgeschnitten
Größe 4252bp
geschnitten mit
AgeI
und
BsrGI
2)
Insert
mRFP wird rausgeschnitten
Größe 689bp
geschnitten mit
AgeI
und
BsrGI
Cloning strategy-Final Construct
pMeCP2_MBD_mRFP
Größe: 4965nt

Backbone: pc841-pMeCP2Y
Insert: pc1054-pENmRFPCNAL2


In vitro - Restriktion

In vitro - Restriktion

1) Smart Ladder
2) Pc841 unverdaut
3) Pc841 verdaut I
4) Pc841 verdaut II
5) Frei
6) Pc1054 unverdaut
7) Pc1054 verdaut I
8) Pc1054 verdaut II
In vitro – Präparatives Gel
In vitro – analytisches Gel zur DNA-Quantifizierung

1) Smart Ladder
2) pc1054 verdaut (
mRFP
)
3) pc841 verdaut (
GOI
)

In vitro - Ligation

Transformation

Transformation - Auswertung
Analytischer Verdau
Inkubation: 1h bei Raumtemperatur
Inkubation 45 min bei 37°C und 350 rpm
Inkubation der Platten: 24 h bei 37°C
Plasmidpräparation
Image Analyse und Fazit
Transfektion
Ko-Transfektion mit gewünschtem und Ausgangsplasmid
Transfektion von C2C12-Zellen
Staining mit DAPI



Transfektion - Schema
1) 2 µg pc841 und 2 µg Klon I

2) 2 µg pc841 und 2 µg Klon II

3) 1 µg pc841 und 1 µg Klon I

4) 1 µg pc841 und 1 µg Klon II
Analytischer Verdau - Miniprep
1) Smart Ladder (5 µl)
2) frei
3) 1. Ligation unverd.
4) 1. Ligation verdaut
5) 3. Ligation I unverd.
6) 3. Ligation I verdaut
7) 3. Ligation II unverd.
8) 3. Ligation II verdaut
9) Klon AR I unverd.
10) Klon AR I verdaut
11) Klon AR II unverd.
12) Klon AR II verdaut
Maxiprep
keine Aufreinigung und Verdau, nur Animpfen

300 ml LB-Medium
300 µl Kanamycin
2 ml DNA-Ansatz



Insert wurde erfolgreich eingebaut
Schwierigkeiten bei der Präparation
Transfektion war erfolgreich, jedoch geringe Effizienz




ImageJ Analyse
ImageJ Analyse- Line Plot
ImageJ Analyse-Scatterplot
Fazit
Sequenzierung
Sequenzierung von mRFP der 4. Ligation
Primer EGFP-seq-rv

Transfektionseffizienz
Kotransfektion:
Plasmid pc841 + pMeCP2MBDmR
(Zelltyp C2C12)

Allgemeiner Ø:
mRFP: 0,10%
YFP: 1,06%


Montage der kolokalisierten Zellen (DAPI,YFP und mRFP)
DAPI & YFP:
Pearson’s R value (no threshold): 0,730
Manders M1 (threshold): 1,000
Manders M2 (threshold): 1,000
Manders correlation coefficent
DAPI&mRFP
:
Pearson’s R value (no threshold): 0,66
Manders M1 (threshold): 0.871
Manders M2 (threshold): 0,898
YFP & mRFP:
Pearson’s R value (no threshold): 0,980
Manders M1 (threshold): 0,977
Manders M2 (threshold): 0,923
ng/µl
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