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LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA

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by

irene garcia

on 17 December 2015

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LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA
Conceptos generales:

BIOLOGÍA MOLECULAR: Se define como la parte de la biología que estudia la composición, estructura y función de las moléculas biológicamente importantes, así como los procesos en los que estén implicadas. Engloba principalmente a proteínas y ácidos nucleicos.

CITOGENÉTICA: Se considera como la parte de la genética que estudia la estructura, función y comportamiento de los cromosomas en la metafase.


Es muy importante saber que tanto el laboratorio de
biología molecular como el de citogenética se
consideran laboratorios de
genética
. De hecho,
en el Real Decreto1277/2003 de 10 de octubre
ambos términos quedan bajo
el nombre de la Unidad de Genética.

1. BIOLOGÍA MOLECULAR Y CITOGENÉTICA
Laboratorio cultivos celulares
: crecimiento de células eucariotas

Laboratorio de citogenética:
estudio de cromosomas eucarióticos


La técnica básica que se lleva a cabo
en un laboratorio de biología
molecular es la REACCIÓN EN
CADENA DE LA POLIMERASA.

EQUIPAMIENTO:



ESPECÍFICO


Y


GENÉRICO.


1.1 EL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
EQUIPAMIENTO

Prevención de la exposición del personal a agentes nocivos e impedir la liberación de estos al exterior.

En función de la naturaleza la seguridad puede ser:

Biológica o bioseguridad: prevención ante agentes patógenos y toxinas.

Química: prevención a la exposición a agentes químicos.

1.4 SEGURIDAD EN EL LABORATORIO
Engloba todas las normas, técnicas, prácticas y hábitos de trabajo q intentan evitar la exposición accidental del personal a agentes biológicos potencialmente peligrosos (patógenos y toxinas) o su liberación.
1.4.1. BIOSEGURIDAD
Ventana frontal
transparente
Sistema
mecánico
Filtros HEPA
de gran
superficie
de pequeña
superficie
Rejilla frontal

Es el aparato en el que se lleva a cabo la PCR (Reacción en cadena de la polimerasa) y está controlado por un microprocesador.

Partes más destacables:

El bloque incubador.
FUNCIÓN: Es capaz de mantener de manera homogénea, durante los tiempos que se requiera, las distintas temperaturas que se programan para cada fase y cada uno de los ciclos de PCR. Hay distintos de modelos de termocicladores dependiendo de la tecnología que utiliza para calentar o enfriar.

La tapa del bloque incubador.
FUNCIÓN: Evitar que el agua de la mezcla de reacción PCR se evapore por efecto de las temperaturas alcanzadas en el bloque incubador y con ello, alterar el desarrollo de la reacción.

Un tipo especial de termociclador es el ciclador a tiempo real.
Este incorpora un sistema de láser y de detecion de
fluorescencia capaz de excitar y medir
la fluorescencia emitida por
cada tubo de reacción individualmente.
Esta tecnología permite detectar la síntensis
de producto a tiempo real.

TERMOCICLADOR.

Revolver de objetivos por
debajo de la pletina

Fuente de luz por
encima de la pletina

Su FUNCIÓN básicamente es separar moléculas de ácidos nucleicos de distintos tamaños, y permite por ejemplo analizar los productos amplificados en una PCR o purificar y obtener fragmentos de tamaños concretos de ADN.

Se lleva a cabo aplicando un campo eléctrico en una disolución tampón en la que se sumerge la matriz que contiene las muestras de ácidos nucleicos y estos migran a través de la matriz.
Esta matriz que se utiliza es un gel de agarosa (mayor tamaño) o bien de poliacrilamida (menor tamaño).

Sus partes constan de:

- Soporte plástico.
- Cubeta de eletroforesis.
- Fuente de alimentación.

EL EQUIPO ELECTROFORESIS
DOCUMENTADOR DE GELES
Microscopio óptico
convencional
Cámara digital
Software
específico
Autoclave
Sistemas de filtrado
ESTRUCTURA
TÉCNICAS
DE
ASÉPSIA
Puerta siempre cerrada y restringir el acceso
Material reutilizable esterilización
Lavado frecuente de manos e uso de batas y guantes
Colocar solo el material que se vaya a utilizar y no sacarlo de su embalaje hasta su uso
Material fungible contenedores
Limpieza de las cabinas y mantenimiento de los filtros HEPA
1.1.1 EQUIPAMIENTO ESPECÍFICO.
Es el que permite realizar técnicas exclusivas de este tipo de laboratorio.

Consta de:

El termociclador.
El equipo de electroforesis.
El documentador de geles.

Y también forma parte de este equipamiento los aparatos necesarios para la realización de procesos específicos, como son:

La extraccion de ácidos nucleicos.
La secuencia de los fragmentos que son objeto de estudio.




1.1.2 EQUIPAMIENTO GENÉRICO Y SUS APARATOS.
Es común con otro tipo de laboratorios.
2. ESTRUCTURA DEL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR
La estructura del laboratorio de biología molecular está condicionada por la técnica principal. La realización de una PCR implica:
Preparación de reactivos
Extracción y purificación de ADN de una muestra biológica
Reacción de amplificación propiamente dicha
Análisis de los productos de la reacción mediante electroforesis y documentación del gel.
Estas actividades deben realizarse en un área de trabajo independiente y con su propio equipamiento y material de trabajo.
Un laboratorio de biología molecular de constar, como mínimo cuatro salas independientes:
1. Sala de preparación de reactivos
Se considera el área limpia, es decir, sin ADN. Además en ella se preparan todos los reactivos que se van a utilizar en el laboratorio incluyendo la mezcla de reacción de PCR. Es fundamental que no se contaminen y para ello es imprescindible que se disponga de una cabina de bioseguridad.
2. Sala de preparación de muestras y extracción de ADN.
Esta es un área sucia, es decir, con ADN, por ello debe tener una presión negativa para evitar una contaminación. Debe contar con una cabina de bioseguridad y un espectrofotómetro.
3. Sala de PCR.
Esta es un área sucia, en la cual tiene una importante fuente de contaminación. Dispone de equipos de electroforesis.
4. Sala de Post-PCR.
Esta sala dispone de termocilcadores para realizar la PCR y otro espacio para añadir muestras de ADN.
Plano esquemático de un laboratorio de biología molecular
2.2 EL FLUJO DE TRABAJO
Hay que tener muy presente el flujo detrabajo ya que marca el sentido único de los proceso en el circuito de trabajo.
post-PCR
PCR
pre-PCR
Siempre unidireccional
limpia
sucia
Este flujo implica que cada área de trabajo
sea autonoma ya que debe disponer de su propia infraestructura básica y el material de trabajo. El material que se aplique debe evitar el retorno de cualquier área.

2.3 LAS CONDICIONES DE TRABAJO
Existen unas condiciones de trabajo específicas para impedir la contaminación de muestras.
Contaminación de muestras
La contaminación es la introducción accidenal en las muestras de material exógeno que altera su pureza.
Contaminación cruzada
Material no extendidos al medio ambiente o microorganismos ambientales. Ejemplo: Como aerosoles generalmente en pipeteo, apertura de tubos Eppendorf, centrifugación,etc.
Contaminación por el propio personal, causando descamación de la piel, pelo, guates contaminados.
Contaminación de las superficies de trabajo.
Contaminación por productos amplificados
Generados mediante PCR por el propio laboratorio.
Contaminación de los reactivos comerciales y del material fungible
La mayoria de los fabricantes garantizan la esterilidad de sus productos, ya que algunos métodos de esterilización no garantiza la eliminación del ADN de los microorganismos ni la inactivación de las enzimas.
Esta causa resultados erróneos o no interpretables. Los dos tipos más contaminantes son: Ácidos Nucleicos extraños y enzimas.
Las fuentes contamienantes pueden ser
Normas para la manipulación de materiales
Cuando hayamos identificado la contaminación habra que intentar anularla o preveneirla. Para ello se requiere el uso de buenos hábitos de trabajo en las condiciones de técnicas asépticas.
Cabina de bioseguridad
Sistema de purificación de agua
Espectrofotómetro
Se deben de utilizar cabinas de flujo laminar vertical de clase II .
Protegen de la contaminación a la personan, a la muestra y al medio ambiente.
El laboratorio de biología molecular requiere un suministro estable de agua purificada tipo II y agua ultrapura II.
Mide la concentración de ácido nucleico de una muestra y su pureza.
Microscopio de luz transmitida y fluorescencia
El RD 363/1995 aprueba el reglamento sobre notificación de sustancias nuevas y clasificación, envasado y etiquetado de sustancias peligrosas, establece hasta 15 tipos de sustancias peligrosas con base en sus características fisicoquímicas, toxicológicas y peligrosidad para la salud humana.
1.4.2 SEGURIDAD QUÍMICA
Estos son imprescindible para interpretar las técnicas de hibridación in situ fluorescente.
Es un recipiente de presión que realiza una esterilización con vapor de agua. Este es
imprescindible para trabajar con microorganismo
Autoclave
Muchos de los reactivos utilizados en los laboratorios de biología molecular y citogenética se encuentran dentro de estas categorías.
Las prácticas de laboratorio deben incluir medidas para:

-Prevenir la exposición del personal a estas circunstancias, entendiendo por exposición el contacto con ellas por penetración cutánea, inhalación o ingestión.
-Su almacenamiento seguro.
-Gestión eficiente de los residuos que generen.

Estas medidas se establecerán con base en el catálogo de productos utilizados en la Ficha de Datos de Seguridad (FDS) específica de cada producto, aporta 16 apartados relativos a la composición, manipulación, peligros, vías de exposición, efectos tóxicos, almacenamiento, eliminación y primeros auxilios. La FDS debe ser suministrada por el distribuidor y debe guardarse para su posible consulta por todo el personal.

Medidas genéricas:

-Utilización de los EPI adecuados a cada producto.
-Prohibición de pipetear con la boca.
-Manipulación de productos volátiles en el interior de campanas de aspiración de gases.
-Manipulación de productos inflamables alejados de fuentes de calor y llamas.
-Correcto etiquetado de todos los envases que contengan agentes químicos, incluyendo las soluciones stock y preparadas a partir de productos puros. Debe incluir: el nombre, la fecha y el pictograma de peligro, en su caso.
-Almacenamiento de productos químicos en armarios adaptados.


Estos dependen de las muestras que se
estudien y de las técnicas que se apliquen.
Por ejemplo:
con bacterias se necesitarán estufas de cultivo.
con cultivos celulares se requeriran incubadoras con CO2.

Incubador o estufas
Pictogramas de sustancias peligrosas:
Baño termostático, termobloque y placa calefactora
Baño termostático
termobloque
placa calefactoria
1.4.3 EQUIPAMIENTO Y NORMAS DE SEGURIDAD
La distribución del laboratorio, las instalaciones, la señalización y el equipamiento deben ser los adecuados para minimizar y prevenir los riesgos, en concreto:
Deben disponer de instalaciones de emergencias señalizadas, duchas de emergencia, lavaojos, extintores, etc.
Estos tienen que tener rotores que permitan centrifugar de tubos de 50ml a 0,2ml.
Centrífuga y microcentrífuga
Estar dotados con los equipos de protección individual (EPI) adecuados, según las muestras que se manipulen, guantes, batas desechables, gafas de seguridad, mascarillas, pantallas, etc..
Son fundamentales para conservar los reacivos y las muestras.
Los reactivos se consevan a -20ºC y las muestras de ADN deben realizarse a -80ºC
Neveras y Congeladores de -20ºC y -80ºC
Contar con un manual de seguridad y un plan de gestión de residuos.
Se pueden incluir equipamientos básicos como: balanza, agitadores magnéticos para preparación de reactivos, vórtex, etc
Otros equipamientos
-Lavado frecuente de manos.
-Utilización de los EPI adecuados.
-Ropa de trabajo adecuada y abrochada, evitando mangas largas y zapatos abiertos.
-Prohibición de comer, beber, fumar y maquillarse.
-Uso de gafas de seguridad cuando se llevan lentes de contacto.
-Prohibición de pipetear con la boca.
-Recibir la información adecuada para el manejo de los aparatos.
-Conocer el plan de gestión de residuos y el manual de seguridad del laboratorio y cumplir las normas.


NORMAS BÁSICAS QUE DEBE CUMPLIR EL PERSONAL:
OTROS TIPOS DE LABORATORIOS
Morfológica
Molecular
Documento de obligado conocimiento de todo el personal. Debe contener:

-Evaluación de los riesgos inherentes a cada puesto de trabajo en el laboratorio.
-Descripción y normas de utilización del equipamiento de seguridad del laboratorio (cabinas de bioseguridad, cabinas de aspiración de gases EPI, etc.).
-Hábitos de trabajo apropiados para minimizar los riesgos de exposición.
-Normas de almacenamiento de productos químicos.
-Normas para la eliminación de desechos y gestión de residuos, incluyendo los derrames.
-Normas de actuación en casos de emergencias, accidentes biológicos y químicos.


1.4.4 EL MANUAL DE SEGURIDAD
Los laboratorios deben disponer de un plan de gestión de tóxicos y peligrosos, debe incluir medidas para la recogida selectiva, la clasificación y el almacenamiento temporal de residuos hasta su recogida por una empresa gestora.

Se deben especificar medidas para gestionar:

-Residuos biosanitarios especiales. Objetos punzantes y cortantes que han estado en contacto con productos biológicos, cultivos microbiológicos y material contaminado con los mismos, cultivos celulares, grandes cantidades de sangre y otros líquidos biológicos, etc.
-Residuos químicos. Envases que han contenido productos químicos, reactivos caducados o innecesarios, los EPI contaminados, los filtros de cabinas de aspiración, los derrames, etc.
-Residuos citotóxicos. Restos de productos carcinógenos, Mutágenos y Teratógenos y envases que lo contengan.
-Residuos radioactivos.
Los residuos se recogen en:
Contenedores para los residuos sólidos.
Garrafas en el caso de residuos líquidos.
Y deben cumplir con:
Estar homologados y ser específicos para cada tipo de residuo.
Ser diferenciados por código de color.
Estar etiquetados.

No se deben llenar más de 2/3 de su capacidad y deben cerrar herméticamente.
Debe especificar las normas de actuación en caso de derrames.
1.4.5 GESTION DE RESIDUOS
DERRAMES:
Para cultivos celulares
Para citogenética
Común

Cabina de seguridad biológica tipo II
Son cámaras de circulación forzada a través de un filtro HEPA.

Manipulaciones de
cultivos
Balanza
Agitador
magnetico
Vórtex
El baño termostático proporciona un calentamiento indirecto, es decir, se calienta un elemento intermedio en el que se ha colocado un recipiente con el producto.
Microscopio invertido
Para la observación directa de los frascos de cultivos.
El termobloque es un equipo que calienta uniformmente un bloque metálico en el que se encuentran una serie de tubos con la sustacia que se va a calentar.
Incubador de CO2
Aparato que proporciona las condiciones ambientales óptimas para el crecimiento del cultivo


Incubador roller
Para cultivos celulales que solo crecen en monocapa
La placa calefactora es un aaparato que proporciona calor seco.
Control de la temperatura
Recircularización del aire interior
Control C02
Control de humedad
Equipo de criogénia
Permite conservar a largo plazo y de forma viable las muestras
Lavado de manos
Uso de equipos de protección individual (EPI)
Los principales son los guantes sin talco, bata y mascarilla
Descontaminación de superficies
Prevención de contaminación ambiental
Equipo de análisis de imagen
Para documentar y analizar metafases
El lavado frecuente norma de higiene básica, independientemente de usar guantes
Microscopios
Para el recuento de células, estudios de viabilidad, visualización de hibridación in situ fluorescente (FISH)
Método
físico
Equipo de esterilización
Es imprescindible la esterilidad para en materiales y reactivos
Método químico
Por ejemplo: irradiación con luz UV
Es imprescindible el uso de:
Cabinas de bioseguridad de clase II
Puntas de micropipeta especiales
- Desplazamiento positivo: tienen en el interior un embólo o pistón que las convierte en autenticas microjeringas.
- Puntas con filtro: impiden que los posibles aerosoles alcancen el cuerpo de la pipeta.
Prevención de carryover: evitar la contaminación acumilada de PCR
Por ejemplo: el lavado con soluciones de hipoclorito sodico o descontaminantes comerciales
Otros equipamientos
Neveras y congeladores de -20ºC y -80ºC
Para conservar a temperatura adecuada los diferentes reactivos
Para preparar reactivos y medios de cultivo
Sistema de purificación de agua
2.4 El uso eficiente de los recursos
El equipamiento de este laboratorio tiene un elevado coste por ello es imprescindible implantar estandares de calidad adecuados para el buen funcionamiento.
El uso de los recursos deberan completar:
Equipamiento e
infraestructuras
Reactivos
Recursos
Humanos
Técnicas
Gestión Medioambiental
Su FUNCIÓN es hacernos visualizar las bandas de ácidos nucleicos en el
gel después de la electroforesis y obtener una fotografía de él.

Y consta de:

Un TRANSILUMINADOR. Consiste en una luz ultravioleta cuya función
hace que visualicemos las bandas correspondientes a las moléculas de ácidos
nucleicos.

Una CÁMARA FOTOGRÁFICA. la visualización del gel se realiza con una
cámara fotográfica adecuada para trabajar con la luz ultravioleta.


Para EVITAR el peligro, en los documentadores actuales suelen incluir el
transiluminador dentro de una cámara oscura, de manera que la fuente de luz
solo se puede encender cuando la cámara este cerrada.
TIPOS DE RIESGOS
Tipos de riesgo para la salud humana y el medio ambiente:
Tipo 1: Riesgo nulo o insignificante.
Tipo 2: Riesgo bajo.
Tipo 3: Riesgo moderado.
Tipo 4: Riesgo alto.
Esta valoración la establece el Real Decreto 178/2004 (anexo I) donde se describen los elementos que se deben tener en cuenta y el procedimiento que se aplica para realizar la evaluación.
También establece el (anexo II) las medidas de protección y confinamiento, según el tipo de actividades desarrolladas en el laboratorio.
Se debe aplicar como mínimo las medidas de protección y contención de nivel 2.
EQUIPO:
Superficies resistentes a ácidos, álcalis, disolventes, desinfectantes y agentes de descontaminación y de fácil limpieza (mesa).
Recinto o campana de seguridad microbiológica (opcional).
Autoclave (en el edificio).
NORMAS DE TRABAJO:
Acceso restringido.
Señalización de un peligro biológico en la puerta.
Medidas específicas para el control de la formación y difusión de aerosoles.
Indumentaria de protección (adecuada).
Guantes (opcional).
Medidas de confinamiento (grado 2):
Instalaciones adecuadas para el almacenamiento de sustancias tóxicas y peligrosas, armarios para inflamables y armarios para sustancias químicas tóxicas y corrosivas
Tener contenedores adecuados para la recogida selectiva y la clasificación de residuos.
Disponer de kits para recogida de derrames de productos químicos y citotóxicos.
El principal problema de bioseguridad es causado por el trabajo con microorganismos y organismos modificados genéticamente (GMO).
Cualquier muestra biológica debe considerarse como potencialmente peligrosa y se debe adoptar las medidas mínimas de protección (EPI).
Accidentes de laboratorio más comunes y entrañan cierta peligrosidad. Implica 3 acciones que deben ejecutarse de forma inmediata

1.Neutralización. Va a depender de las características químicas del producto derramado.

2.Absorción. El material absorbente que se use dependerá de la naturaleza del derrame. Ejemplos:

-Serrín para líquidos no inflamables ni tóxicos corrosivos.
-Carbón activo, para líquidos inflamables, tóxicos o corrosivos.
-Absorbentes-neutralizadores comerciales, para derrames líquidos según las indicaciones de la casa comercial.
-Celulosa para absorber pequeñas cantidades.

3. Eliminación. El residuo se introduce en un envase adecuado y se elimina en el contenedor específico.
Los derrames de productos en polvo se recogen directamente, evitando la formación de aerosoles y de polvo en suspensión.
Los derrames de productos volátiles tóxicos por inhalación recogidos con celulosa deben ser eliminados rápidamente en envases adecuados con cierre hermético; o poner la celulosa en una cabina de aspiración de gases con filtro de carbón activo hasta su evaporación y posterior tratamiento como residuo químico.
Durante estas actividades:

-Debe restringirse el acceso al laboratorio
-Las personas responsables deben estar equipadas con los EPI adecuados al producto derramado.
-Tener especial cuidado con derrames de líquidos inflamables y volátiles.
Miembros
Irene García Rodríguez
Belén Lázaro Borromeo
Rocío Galiano Saavedra
Elisabeth Chacón Barranquero
Las prácticas de laboratorio deben incluir medidas para:

-Prevenir la exposición del personal a estas circunstancias, entendiendo por exposición el contacto con ellas por penetración cutánea, inhalación o ingestión.
-Su almacenamiento seguro.
-Gestión eficiente de los residuos que generen.

Estas medidas se establecerán en la Ficha de Datos de Seguridad (FDS) específica de cada producto, aporta la composición, manipulación, peligros, vías de exposición, efectos tóxicos, almacenamiento, eliminación y primeros auxilios. La FDS debe ser suministrada por el distribuidor y debe guardarse para su posible consulta por todo el personal.

Medidas genéricas:

-Utilización de los EPI adecuados a cada producto.
-Prohibición de pipetear con la boca.
-Manipulación de productos volátiles en el interior de campanas de aspiración de gases.
-Manipulación de productos inflamables alejados de fuentes de calor y llamas.
-Correcto etiquetado de todos los envases que contengan agentes químicos, incluyendo las soluciones stock y preparadas a partir de productos puros. Debe incluir: el nombre, la fecha y el pictograma de peligro, en su caso.
-Almacenamiento de productos químicos en armarios adaptados.


BUENAS PRACTICAS DE LABORATORIO
Real Decreto 178/2004, de 30 de enero, por el que se aprueba la utilización confinada, liberación voluntaria y comercialización de organismos modificados genéticamente.
INCOMPATIBILIDAD EN EL ALMACENAMIENTO DE PRODUCTOS QUIMICOS


Ambos tienen puntos en común
Plan de mantenimiento
Controles
de caducidad
Nuevo personal
debe recibir
una formación
Debe haber procedimientos normativos
Debera contar con códigos de prácticas medioambientales
Técnicas Asépticas
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