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Microarreglos de DNA

Biología Molecular
by

Memo Santos Veloz

on 27 May 2015

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Transcript of Microarreglos de DNA

MICROARREGLOS DE ADN
¿Qué son los Microarreglos?
Impresión de Microarreglos
Marcador de RNA
Lectura de Microarreglos
BIBLIOGRAFÍA
¿Cuál es su fundamento?
Se fundamentan en la capacidad que tiene una cadena de DNA de acoplarse a su cadena complementaria de DNA (hibridación).
Interacción molecular mediante el establecimiento de puentes de hidrógeno entre los nucleótidos de ambas cadenas.
La especificidad de unión de las cadenas, así también como la intensidad de la misma depende en gran medida de la longitud que tengan dichas cadenas.
Entre más grandes sean las diferencias entre las secuencias a evaluar se tienen menos probabilidades de que se presente una hibridación entre dos cadenas que no sean complementarias (hibridación inespecífica).

Mecanismo de Acción
Superficies
Obtención de Muestra
Denominado DNA chip, oligonucleotide DNA chip o gene chip, es un conjunto ordenado de genes en una pequeña superficie (10,000 muestras por cm2). Una de las principales características de los microarreglos es el gran volumen de datos que se generan. Por tanto, uno de los grandes retos en este campo involucra el manejo e interpretación de estos datos.
Las superficies sobre las que se pueden imprimir los microarreglos de DNA son dos, las membranas de materiales como la nitrocelulosa o el nylon y las laminillas de vidrio o epóxico, semejantes a las que se utilizan para microscopía.
El procedimiento consiste en aplicar la solución de hibridización con las sondas sobre la laminilla y cubrirla con un cubreobjetos para permitir que la solución cubra todo el microarreglo de igual forma que se hace una preparación para microscopía.
Interpetación de los Resultados
Cuantificación de Microarreglos
Consiste en una superficie cristalina sólida, generalmente una laminilla de microscopio.
Se adhieren moléculas específicas de ADN con el propósito de detectar la presencia y abundancia de moléculas complementarias marcadas en una muestra biológica.
En la mayoría de los experimentos de microarreglos los ácidos nucleicos marcados derivan del ARN mensajero (mARN) del tejido muestra.
El microarreglo mide la expresión de un gen, cuantificando, de forma relativa, la abundancia de moléculas adheridas.
Existen varios tipos de impresores para los microarreglos y los podemos separar en dos clases principales:

De contacto:
deposita las muestras haciendo contacto con la superficie.
Piezoeléctricos:
un aplicador ultrasónico deposita la muestra.
1. Aislar el ARNm de ambos tejidos.
2. Obtener sus correspondientes ADNc (genes).
3. Deben marcarse con un compuesto fluorescente diferente.
4. El ADNc del tejido objeto de estudio se marca con el compuesto fluorescente Cy3 (rojo) y el del tejido control con compuesto Cy5 (amarillo/naranja).
5. Se mezclan ambos ADNc marcados y se incuban juntos en el microarreglo de ADN.

Cuanto mayor sea la hibridación de una especie determinada de ADNc marcado con el ADNc del microarreglo de ADN, mayor será la expresión tisular original del ARNm correspondiente (expresoma).
Síntesis invitro de cDNA de cadena sencilla.
RNA total junto con un deoxioligonucleótido poli T y un conjunto de hexámeros al azar.
Se agregan los deoxinucleótidos A, C, G y T, mas una proporción de deoxinucleótido T marcado con una molécula fluorescente
(dUTP-Cy3, dUTP-Cy5, dUTP-alexa3 y dUTP-alexa5).
Se agrega transcriptasa inversa.
Finalmente el cDNA marcado se purifica para eliminar el deoxinucleótido fluorescente en exceso.
Existen dos tipos de lectores de microarreglos:
Lectores con cámaras digitales:
registra la imagen fluorescente como si se tomara una fotografía común.
Lectores confocales:
hace una reconstrucción de la imagen utilizando los principios de la microscopía confocal (Fotomultiplicadores).
Se aplica un filtro para depurar la imagen de pequeñas imperfecciones o señales no deseadas
Genera una retícula en la que se definen las áreas,
Se determina una zona de exclusión y el área para calcular la señal de fondo de la imagen.
Definidos estos parámetros el programa calcula la densidad de los pixeles en cada área definida, dando como resultado una tabla con las coordenadas, los valores de densidad, fondo y señal para cada una de las muestras en el microarreglo.
Se requiere del análisis estadístico.
Se trata de discriminar entre los miles de datos.
También se existen programas que permiten agrupar a los genes ya sea por su nivel de expresión, función, estructura, etc. Estos procedimientos estadísticos y de agrupamiento es lo que actualmente se conoce como bioinformática.
http://bq.unam.mx/wikidep/uploads/MensajeBioquimico/Mensaje_Bioq03v27p097_Jorge_Ramirez.pdf
http://www.medigraphic.com/pdfs/alergia/al-2009/al092c.pdf
http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=181221636005
http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones/libros/710/microarreglos.pdf
http://posgrado.itlp.edu.mx/uploads/51d1ee776fd64.pdf
Aplicaciones
En microbiología se han usado para caracterizar cepas de microorganismos y establecer la presencia de factores de virulencia en cepas de interés clínico.
También se han empleado para comparar los niveles de expresión de alelos con polimorfismos y mutaciones (inserciones y deleciones de material genético), estudios de evolución, análisis farmacológicos, cinéticas para el análisis transcripcional, etc.
En la clínica del trasplante han encontrado un gran campo de aplicación.
Mejores esquemas de tratamiento con inmunosupresores para los pacientes trasplantados.
En oncología los microarreglos se han usado para identificar y diagnosticar algunos tipos de cáncer que son difíciles de establecer de manera clínica
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