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Marcadores de Calidad Seminal

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Gemma López

on 24 November 2014

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Transcript of Marcadores de Calidad Seminal

Marcadores de Calidad Seminal
Seminograma avanzado: podemos tener más información?
Gemma López
Laboratorio de Andrología
CIRH-Clínica Corachan. Barcelona
glopez@cirh.es

REACCIÓN ACROSÓMICA
Es el proceso fisiológico que produce la liberación de los contenidos de enzimas proteolíticos del acrosoma para permitir la fusión de las membranas plasmáticas, y la entrada del espermatozoide al óvulo.
REACCIÓN ACROSÓMICA
- Se puede medir la reacción acrosómica espontánea o bien la reacción acrosómica inducida (por ionóforos de calcio, progesterona, componentes de la ZP).
- Fenómeno que debe producirse de manera muy coordinada y precisa en el tiempo.
- Si es inadecuada, puede interferir en la fertilidad

Varias maneras de cuantificar este fenómeno: basadas en el marcaje del contenido acrosomal, o de las membranas acrosomales interna o externa.
REACCIÓN ACROSÓMICA
Se utilizan las aglutininas de guisante (Pisum sativum aglutinin – PSA) o de cacahuete.

REACCIÓN ACROSÓMICA
No existe mucha bibliografía que confirme los resultados de los tratamientos de reproducción asistida con la reacción acrosómica:
REACCIÓN ACROSÓMICA
Tiene un valor predictivo bajo, por lo que no se ofrece comúnmente como parte del análisis rutinario de semen en los centros de reproducción.
El metabolismo aerobio normal de las células produce como desecho diferentes radicales libres que pueden tener consecuencias dañinas para las estructuras celulares.
ESTRÉS OXIDATIVO
ESTRÉS OXIDATIVO
Causas del estrés oxidativo:
> Tratamientos en el laboratorio
> Metabolismo normal
> Habitos tóxicos
> Tabaquismo
> Polución ambiental

ESTRÉS OXIDATIVO
ESTRÉS OXIDATIVO
FRAGMENTACIÓN DEL DNA
> Espermiogénesis:
- Nucleasas endógenas
- Inducción incontrolada de apoptosis

> Migración de espermatozoides desde los túbulos seminíferos al epidídimo

> Activación de caspasas y endonucleasas por factores físico-químicos
> Son roturas del ADN de cadena doble o simple
> Es de origen multifactorial
> Tiene mayor incidencia en individuos estériles

FRAGMENTACIÓN DEL DNA
Peróxido de hidrógeno
Anión superóxido
Radicales hidroxilo
ROS
Lactato y Piruvato
Epinefrina
Alfa-Tocoferol
Catalasa
GSH reductasa
Superoxido dismutasa
GSH peroxidasa
Antioxidantes
Déficit ROS
Estrés oxidativo
Niveles fisiológicos ROS
Taurina e Hipotaurina
ESTRÉS OXIDATIVO
La alteración de la expresión o la actividad de las moléculas relacionadas con el mantenimiento de los niveles fisiológicos de radicales libres pueden conducir a situaciones de subfertilidad.
ESTRÉS OXIDATIVO
Radicales libres (ROS)
Corresponden a un grupo de moléculas con uno o más electrones desapareados, y que por tanto, pueden llegar a modificar moléculas oxidándolas.
Bajas concentraciones no afectan a la movilidad pero suprimen la unión con el ovocito
Aitken, 1993
Kothari, S, 2010

Mide en 45 min la concentración de aniones superóxido a través de un gel reactivo que cambia de color.
Cuanto más oscuro es el color más superóxido hay en la muestra.
FRAGMENTACIÓN DEL DNA
FRAGMENTACIÓN DEL DNA
MECANISMOS DE FRAGMENTACIÓN
1. Endógenas
Generación de radicales libres, stress oxidativo (leucocitos, restos celulares, etc.)
Fallos en el intercambio de histonas por protaminas, o empaquetamiento anormal de la cromatina
Apoptosis defectuosa (liberación de espermatozoides con fragmentación elevada)
2. Exógenas
Tratamiento médico (Quimio/Radio...)
Contaminación ambiental
Tabaquismo
Fiebre alta
Varicocele
Edad avanzada
CAUSAS DE LA FRAGMENTACIÓN
SCSA:
Sperm Chromatin Structure Assay. Mide la susceptibilidad del ADN nuclear a la inducción de la desnaturalización mediante solución ácida. Se valora mediante Citometría de Flujo.

CometAssay:
por electroforesis en gel de células individualizadas

TUNEL:
Marcado fluorescente de roturas en el ADN utilizando reacciones enzimáticas in situ

SCD:
Sperm Chromatin Dispersion (kit Halosperm). Test basado en la desnaturalización/descondensación diferencial de la cromatina
TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS DE LA FRAGMENTACIÓN DEL DNA
FRAGMENTACIÓN DEL DNA
Espermatozoides con ADN fragmentado
Espermatozoides con ADN NO fragmentado
1. Inmersión de espermatozoides en microgel de agarosa y extensión sobre portaobjetos.

2. Tratamiento de muestra con solución desnaturalizante y de lisis.

3. Deshidratación, tinción y visualización al microscopio.
Separación hebras ADN
Lisis
Separación ADN
7´ 22ºC
Lisis 25´ 22ºC
FRAGMENTACIÓN DEL DNA
INTRODUCCIÓN
=
INTRODUCCIÓN
CÉLULAS REPRODUCTIVAS HUMANAS
INTRODUCCIÓN
> Transportar hasta el ovocito 23 cromosomas minimizando el daño de agentes exógenos:
Cromatina 6 veces más compactada que una célula somática en un volumen 40 veces menor.
Presencia de protaminas que se unen al ADN mediante puentes disulfuro.

> Se trata de una célula haploide (n) en movimiento
¿FUNCIÓN DEL ESPERMATOZOIDE?
No existe una definición simple para designar si un varón es fértil o infértil, ya que la situación puede ser variable en periodos cortos de tiempo e incluso con diferentes parejas.
INTRODUCCIÓN
Hasta el momento, la única herramienta comúnmente aceptada para el estudio del potencial fértil del varón es el
seminograma.
SEMINOGRAMA NORMAL (OMS, 2010):
Volumen: >1.5 mL
Concentración: > 15 mill/mL
Movilidad: >32% A+B
Morfología: >4%
Fértil
Infértil
Resultado del análisis de semen:
El seminograma estándar NO informa del contenido cromosómico del espermatozoide.
INTRODUCCIÓN
No es sinónimo de semen fértil
Anormal
Normal
INTRODUCCIÓN
Factor de infertilidad masculina =
IDIOPÁTICO
Se
desconocen
diferentes
causas de infertilidad
, aparte de alteraciones del análisis básico.
Todo nos lleva a pensar que se necesitan
nuevas herramientas diagnósticas
, que permitan obtener datos clínicos acerca de la prueba máxima de funcionalidad:
EL EMBARAZO Y EL LOGRO DE UN RECIÉN NACIDO VIVO Y SANO.
MAGNIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
La selección a 400x no permite detectar defectos en el núcleo
Riesgo de transmisión de enfermedades genéticas y cromosómicas a los embriones
Basada en las características estructurales del espermatozoide.
La morfología espermática es un buen indicador de la fecundación natural, de la IUI y de la FIV convencional.
Actualmente la selección morfológica para ICSI es
SUBJETIVA y LIMITADA
:
MAGNIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
MAGNIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
Modificación del ICSI convencional: objetivo de alta magnificación (>6000x)
MAGNIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
FISH
MAGNIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
MAGNIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
MAGNIFICACIÓN DE ESPERMATOZOIDES
Ventajas:
Morfología de alta magnificación
Aparentemente mejores resultados tras TRA

Inconvenientes:
Requiere más tiempo que una ICSI convencional
Elevado coste
Sólo aconsejable en determinados casos:
- Semenes pobres (concentración mínima de 5mill/mL)
- Fallos de FIV/ICSI

¿QUÉ SIGNIFICA FISH?
F

I

S

H
FISH EN ESPERMATOZOIDES
FLUORESCENCE

IN

SITU

HYBRIDIZATION
FISH EN ESPERMATOZOIDES
1. Con el cariotipo anormal
> Varones 47 XXY y 47 XYY disomía XX, YY y XY
diploidía

> Varones portadores de translocaciones
Recíprocas 50-70% esperm. desequilibrados
Robertsonianas 15-20% esperm. desequilibrados
(Blanco, 1999 y 2001; Rives, 2003; Estop, 1998)


2. Con cariotipo normal:
en OAT, meiosis en BT alteradas, abortos de repetición y fallos de implantación
INDICACIONES
1. Fijación
2. Descondensación y desnaturalización del ADN de las muestras
3. Hibridación con sondas de ADN
4. Lectura con microscopio de fluorescencia
5. Estadística
PROTOCOLO FISH
FISH EN ESPERMATOZOIDES
> Tratamiento hipotónico: KCl 0.075M, 20 min a 37 ºC

> Fijación con Metanol:Acético (3:1)
1. Fijación de la muestra
FISH EN ESPERMATOZOIDES
> Sondas de ADN marcadas con el fluorocromo (Vysis):
a) Centroméricas
b) Específicas de loci
c) Teloméricas
3. Hibridación con sondas de ADN
> Descondensación: - rotura de puentes S=S
> Desnaturalización: - separación de cadenas de ADN
2. Descondensación y desnaturalización
FISH EN ESPERMATOZOIDES
> Se compara con una población control ya publicada
> Con significado estadístico p<0.05
5. Estudio estadístico
> Se observan normalmente 5 cromosomas:
13, 18, 21, X, Y
> Deben leerse un mínimo de 1000 espermatozoides
> La muestra debe tener un mínimo de: 500.000 espermatozoides
4. Lectura
FISH EN ESPERMATOZOIDES
> Permite
detectar espermatozoides aneuploides

> Células aneuploides pueden
causar
una
disminución
de:
Fecundación
, aunque no siempre
División celular del embrión
, embriones no evolutivos
Implantación
: mayor % de embriones anormales y mosaicos
Gestación evolutiva
: causa de abortos
Niños/as sanas en casa
: niños con patologías genéticas

> Permite
asesorar a la pareja
sobre la conveniencia de:
Diagnóstico prenatal / amniocentesis
DGP por aumento de anomalías en algunos cromosomas
Pasar a banco por aumento de anomalías en todos los cromosomas

FISH EN ESPERMATOZOIDES
APOPTOSIS
APOPTOSIS Y VITALIDAD
Proceso de muerte celular programada en organismos multicelulares.

Compleja cascada de eventos secuenciales regulados enzimáticamente que controlan la muerte celular asociada a la fragmentación de la cromatina.
APOPTOSIS
La condensación nuclear y la fragmentación del ADN mediada por endonucleasas son pasos esenciales en la muerte celular por apoptosis.
APOPTOSIS Y VITALIDAD
FUNCIÓN DE LA APOPTOSIS EN ESPERMATOZOIDES
1) Mecanismo para eliminar células espermáticas dañadas:
- pérdida de movilidad,
- proceso ineficiente, no evita fertilización

2) Es una forma de senescencia regulada que permite la eliminación "silenciosa"de estas células del tracto reproductivo una vez han perdido su viabilidad (expresión de
Fosfatidilserina
)
APOPTOSIS Y VITALIDAD
Test OxiSperm (Halotech)
OS ESPERAMOS!!
SPERM CHROMATIN DISPERSION TEST (SCD)
SPERM CHROMATIN DISPERSION TEST (SCD)
SPERM CHROMATIN DISPERSION TEST (SCD)
Fácil
Rápido (aproximadamente 1 hora)
En cualquier laboratorio
Con equipamiento laboratorial básico
Posibilidad de procesar varias muestras simultáneamente
SPERM CHROMATIN DISPERSION TEST (SCD)
J. Gosalvez, UA Madrid
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