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INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACION

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Luis Elias Urupeque Reyes

on 14 October 2014

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Transcript of INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACION

BIOMONITOR ALLIUM CEPA
Se realizaron dos ensayos exploratorios con el método de allium test (fiskesjö, 1985).
Primero se asignaron 15 bulbos de Allium cepa divididos en 3 recipientes con agua corriente, dejando las raíces sumergidas en el agua corriente por un lapso de tiempo de 4 días
Segundo ensayo exploratorio se sumergieron 15 bulbos de Allium cepa en una solución que contenía 50% de agua corriente y 50% de agua procedente del dren 4000; otros 15 bulbos de Allium cepa se sumergieron en agua del dren 4000 al 100%, por 4 días Pasado este tiempo se cortaron los ápices de las raíces de los tres medios de cultivo.


RESUMEN
luego fueron puestos en viales que contenían el fijador carnoy, los ápices cortados del grupo control fueron puestos en tres viales llamados R1, R2 Y R3, el mismo procedimiento se siguió par los medios de 50% y 100%. Los ápices se quitaron del fijador y se procedió a su tinción con la orceina,
Las aguas de 50% y 100% tuvieron efectos inhibitorios sobre la actividad celular, provocando aberraciones citológicas (invaginaciones citoplasmáticas, células redondeadas, bi-nucleadas) y disminución del índice mitótico con respecto al testigo
PREPARACIÓN DEL MATERIAL BIOLÓGICO
RESULTADOS
INTRODUCCIÓN
Por su capacidad para detectar cambios en la calidad de los efluentes y controlar que la toxicidad esté por debajo de los límites permitidos, los ensayos o test biológicos se están transformando en herramientas valiosas para la evaluación del impacto ambiental.
Comparativamente con las pruebas analíticas rutinarias, estos bioensayos ofrecen una cantidad de ventajas para el diagnóstico ecotoxicológico.
los bioensayos son instrumentos simples, rápidos, económicos y pueden ser ejecutados con diferentes especies (especialmente las de fácil disponibilidad y que germinen y crezcan rápidamente).
el Allium test (Fiskesjö, 1988), están demostrado una potencialidad diagnóstica significativa (Kristen, 1997).
El Allium test es un bioensayo que permite determinar la toxicidad total y genotóxicidad de diferentes agentes tóxicos o contaminantes (Fiskesjö, 1993), a partir de la observación del crecimiento y las mutaciones cromosómicas del ápice radical de la cebolla (Allium cepa).

Purificación
EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN
A. PASO PREVIO OBTENCIÓN DE LA MUESTRA.
Se obtuvo la muestra de los bulbos de cebolla, los cuales se lavaron en solución de hipoclorito de sodio a 1%

B. PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA.
1. Obtener en el mortero estéril aproximadamente 25 mg de muestra y agregar 50-75 ul de T.E 20:5 y triturar lentamente.
3. Colocar la muestra triturada en tubo Eppendorf de 1.5 ml y agregar 350 ml a 500 ul de Buffer de lisis.
4. Llevar baño maría a una temperatura de 65° C por 1Hora. Agitar cada 5 minutos.
5. Precipitación de las proteínas: Agregar 350 ul de fenol-cloroformo –alcohol isoamílico directamente a la muestra lisada y agitar vigorosamente por 10-15 minutos.
6. Centrifugar la muestra a 10000 rpm por 10 minutos.
7. Rescatar el sobrenadante.
8. Precipitación de los ácidos nucleicos: Agregar al sobrenadamente 400 ul de isopropanol por cada 700 ul de sobrenadante obtenido.
9. Observar la formación de una pelusa blanquecina en interfase y luego mezclar por inversión.
10. Centrifugar a 10000 rpm por 10 minutos.
11. Eliminar el sobrenadante cuidadosamente y observar la formación de sedimento o botón de ADN.
12. Lavar con 200 ul de etanol al 70% +TE y centrifugar a 80000 por 10 minutos.
13. Descartar el sobrenadante y realizar el mismo procedimiento anterior utilizando 150 ul de etanol 70%+ TE.
14 .Resuspender El pellet de ADN en 100-150ul de TE .20:5 y verter el contenido en un tubo de 0.5 ml o colector de ADN

CORRIDA ELECTROFORETICA
Preparación del agar (0.75 mg + 50 ml de TBE)
Agregar bromuro de etidio 5ul
Añadir el agar preparado al peine.
Dejar solidificar
Tener listo el colorante (azul de bromo fenol)
Ejercer una especie de lavado con los 25ul de muestra.
Depositar la muestra
Colocar el gel en la cubeta de corrida.
Conectar los cables de la cubeta a una fuente de corriente continua (comprobar la polaridad: rojo (+), negro (-).
120 volts
Visualización de las bandas en transiluminador

Lambayeque, del 2014

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS DECANATO


INFORME FINAL DE PROYECTO DE INVESTIGACIÓN

TITULO : Genotóxicidad de aguas residuales del DREN 4000 en meristemos del biomonitor Allium cepa, Agosto –Octubre ,2014.

AUTORES :
Ests: Chugna Zuloeta Jose, Ilatoma fustamente Gilber, Ramos Sono Daniel, Santamaría Veliz Olivia
ASESOR: Msc. Jhon García López



Díaz (2004), Ensayo de toxicidad aguda con bulbos de cebolla Allium cepa L mediante la evaluación de la inhibición del crecimiento promedio de raíces .Para la elaboración de las pruebas se deben seleccionar bulbos de Allium sp. (Cebolla amarilla) de 1.5 cm de diámetro, secos y sin formación de hojas o raíz.
Noriega (2007),estudio de genotoxicidad de Picrasmacrenata(Vell.) Engl. Simaroubaceae, Los objetivos de este trabajo son: determinar la actividad de las infusiones sobre el desarrollo de raíces y la división celular mediante el Test de Allium cepa; analizar la correlación de las concentraciones y los parámetros macro y microscópicos e interpretar la posible genotoxicidad de la infusión.
Fiskesjo (1985, 1993, 1997) Cuando un bulbo de cebolla (Allium sp.) se rehidrata se produce una estimulación del crecimiento de las células, lo cual permite la elongación de las raíces. Sin embargo, cuando la hidratación se lleva a cabo en presencia de sustancias toxicas, la división celular de los meristemos radiculares puede inhibirse,
Smaka-kincl et al.(1996) identificación de parámetros citológicos en meristemos de cebolla tratados con efluentes industriales y aguas municipales, tales como inhibición de la división celular, aparición de células aberrantes tanto en metafase como en anafase y aumento de células con micronúcleo en la interfase.
Odeigah et al. (1997). al estudiar las propiedades tóxicas y genotóxicas de desechos sólidos de industrias nigerianas, encontraron que las mezclas lixiviadas causaron modificaciones de los índices mitóticos y alteraciones en profase, metafase, anafase y telofase.
Rank y Nielsen (1998), Manosalva et al.(1999) y Nielsen (1997), al estudiar los efectos citotóxicos y mutagénicos de insecticidas de uso frecuente, pertenecientes al grupo de carbamatos; y al evaluar los efectos de aguas de desagüe provenientes de industrias papeleras dinamarquesas con altas concentraciones de metales pesados, respectivamente.
ANTECEDESTES
Materiales y Métodos
A.LUGAR DE EJECUCION DE LA INVESTIGACION
EL presente trabajo se realiza en laboratorio de Genética aplicada de la UNPRG.
B.MATERIAL
1. POBLACION Y MUESTRA
La población estuvo constituida por bulbos de cebolla (Allium cepa), de 2 a 3 cm de diámetro, los cuales fueron obtenidos del mercado mayorista Moshoqueque.
2. MATERIAL BIOLOGICO
Raíces de los bulbos de cebolla (Allium cepa), los cuales estarán sometidos a diferentes concentración del agua residual del Dren 4000, pero en primer tiempo un grupo para grupo control (agua).
3. MATERIAL DE LABORATORIO

C.METODO
1. TIPO DE ESTUDIO
El presente estudio de acuerdo al fin que percibe es del tipo aplicativo y según la técnica de contrastación es experimental.

2. DISEÑO DE INVESTIGACION

El presente trabajo de investigación se ejecutará utilizando el diseño experimental de estímulo creciente (Hernández et al., 2003).

PREPARACIÓN DE LAS SOLUCIONES
Exposición de los meristemos del biomonitor Allium cepa a
agua residuales provenientes del dren 4000.

PREPARACION DE MUESTRAS PARA OBSERVACIONES MICROSCOPIA

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