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Soutenance de stage Master 1 Biologie Santé

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Audrey Desclaux

on 17 January 2015

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Transcript of Soutenance de stage Master 1 Biologie Santé

Soutenance de stage Master 1 Biologie Santé
INTRODUCTION
T
ravail de
R
echerche
E
ncadré
Détection de bactéries pathogènes chez les rongeurs
Stage réalisé du 17 février au 31 mai 2014
Audrey DESCLAUX
Maître de stage : Maria RAZZAUTI SANFELIU

Introduction

Première partie:
Travail Encadré de Recherche
Parallèle TER / Stage

Deuxième partie:
Introduction au stage
Matériel et Méthode
Résultats

Troisième partie:
Conclusion et perspectives
Conclusion Générale
SOMMAIRE
Centre de Biologie pour la
Gestion des Populations (CBGP):

110 personnes dont 75 permanents
2 groupes modèles: rongeurs, insectes.



Réservoirs des maladies émergentes.
http://www1.montpellier.inra.fr/CBGP/


Description génomique + interactions entre les génomes.

Technologies NGS.

Méthodes bioinformatiques.

Grandes quantités de données.

Qu’est-ce que la métagénomique ?
http://bioinfo-fr.net


Microbiome ? -> 454 et Illumina.
Identification agents pathogènes.
Profil taxonomique bactérien de deux localités géographiques
-> pyroséquençage.
4 approches
http://www.forbes.com


4) Amplification de la région V6 -16S ARNr par la technique 454

OBJECTIF:
Identification des bactéries dans de nombreux échantillons (pools)

Protocole:
1) Pools de 2 différentes localités géographiques;
2) Extraction (kit Qiagen) de l’ADN génomique;
3) Réalisation du design des amorces;
4) PCR: Amplification de la région hypervariable V6;
5) Pooling équimolaires des 2 pools;
6) Pyroséquençage 454.


3) Séquençage Illumina

OBJECTIF:
Assemblage des génomes complets des
Borrelia
pour des échantillons positifs

Protocole:
1) ADN génomique des tiques positives à
Borrelia->
fixation à
des sondes ->
dénaturation;
2) Dépot sur « flowcell ».
2) Pyroséquençage 454

OBJECTIF:
Identification de différents genres bactériens chez 1 échantillon de
I.ricinus

Protocole:






-> identification
séquence initiale d’ADN.
1) PCR (Polymerase Chain Reaction) ciblée pour l'amplification de
Borrelia

Amplification fragment d’intérêt

OBJECTIF:
Screening des échantillons -> présence
Borrelia
?

Protocole:
1) Extraction + Filtration ADN génomique
I.ricinus

2) Testé pour
Borrelia burgdorferi
-> PCR.
3) Séquençage Sanger.
MATERIEL ET METHODE
Méthode 4:
Amplification de la région V6 -16S ARNr par la technique 454

-> 108 genres détectés;
-> aucune différence
notable entre les stades de vie et les localités géographiques.
Méthode 3:
Séquençage Illumina

-> reconstitution du
génome complet des 2
Borrelia spp.
Méthode 2:
Pyroséquençage 454
-> Comparaison
profils ADN (rouge) + ADNc (bleu) = présence de bactéries communes
et d’autres non communes.
Méthode 1:
PCR ciblée pour l'amplification de
Borrelia

-> détection de 3
Ixodes ricinus
infectés par
Borrelia spp.
RESULTATS
Similarité(s):
Mise en évidence du pathobiome d’un hôte par des techniques
de métagénomique;
Utilisation de techniques similaires de métagénomique.

Comparaison(s):





Critique(s):








-> Comparaison des différentes approches de séquençage ->
utilisation de différents échantillons pour
chacune des approches = comparaison non établie.
PARALLELE TER / STAGE
Détection de bactéries pathogènes chez les rongeurs
Rat porteur de la peste
http://www.futura-sciences.com
Projet Patho-ID :

Etude de la transmission des agents pathogènes.


Détection de bactéries pathogènes chez les rongeurs


Rongeurs :
-> Impacts = réservoirs

Etude :
-> Communauté microbienne
-> Circulation pathogènes entre populations de rongeurs


Manipulations :
-> Extraction ADN
-> Région V4 ARNr 16S
-> PCR
-> NGS
INTRODUCTION AU STAGE
MATERIEL ET METHODE

http://www.forbes.com
http://www.isogen-lifescience.com/nanodrop-8000
http://www.hellopro.fr/thermocycleurs
5ème étape: PCR
3ème étape: Extraction d’ADN
2nd étape: Prélèvement d'un bout d'organe
4ème étape: Mesure de la concentration en ADN
6ème étape: Migration sur gel d’agarose
7ème étape: Purification des produits
8ème étape: Séquençage MiSeq
1ère étape: L’échantillonnage
4) Séquençage Illumina des produits PCR:
3) Design de la plaque PCR:
MATERIEL ET METHODE

La PCR
1) Segment d’intérêt: Amplification d’un fragment de 385 pb de la région V4 du gène 16SrRNA.
2) Design des amorces:
-> N cycles = N bases -> séquençage par synthèse
-> Lecture -> 1 base = 1 couleur -> reconstitution séquence
sur flow-cell

RESULTATS
-> Extraction d’ADN
->Dosages spectrophotométriques (Nanodrop 8000®)
->Electrophorèse sur gel d’agarose: 3 profils
bonne amplification du gène 16S pendant la PCR.

CONCLUSION ET PERSPECTIVES
Réalisation de mon stage de l'étape du prélèvement d'organe jusqu'à vérification de l’amplification par gel du matériel génétique en ciblant la région V4 de l’ARNr 16S.

Notre étude / Giovanna et al. (2011)
-> point commun : ARN 16S
-> avantages de la technique Illumina pour multiplexer plus d'échantillons

Dernières étapes:
Séquençage avec l’appareil MiSeq Illumina®.
Participation aux analyses bioinformatiques et statistiques pour l'étude de la prévalence des communautés bactériennes.

En juillet et en août (CDD):
Manipulations + terrains sur des échantillons de rongeurs des Ardennes (France).
CONCLUSION GENERALE
Enrichissement de mon expérience professionnelle et personnelle

Affinement de mon travail en laboratoire dans des conditions BPL

Meilleure connaissance de la Recherche et du travail en équipe

Confirmation de mes ambitions d’exercer dans le domaine des biotechnologies

Biodiversité -> prédire évolution
à différentes échelles;
Questions
PCR conventionnelle

Taq Polymérase (enzyme) amplifie une partie spécifique d’un acide nucléique ->
obtenir une quantité suffisante d’acide nucléique pour le détecter = double quantité matériel génétique à
chaque cycle -> amplification exponentielle.

Amorce sens + amorce anti-sens spécifiques des régions flanquantes du fragment à amplifier s’hybrident avec Taq polymérase + excès de désoxyNucléotidesTri-Phosphate (dNTP) + MgCl2 -> synthèse du brin complémentaire de l’acide nucléique.


Sanger

Polymérisation ADN initiée par amorce complémentaire à partie du fragment ADN à séquencer. Les 4 désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) sont ajoutés + 1 des 4 didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP) = terminateurs de chaîne -> incorporés dans nouveau brin synthétisé, empêchent la poursuite de l’élongation.
Pour séquençage complet d'un même fragment d'ADN -> répète cette réaction 4 fois en parallèle avec les 4 didésoxyribonucléotides différents.

Résultat: mélange de fragments d’ADN de tailles croissantes, se terminant tous au niveau du didésoxyribonucléotide incorporé dans la séquence.

Fragments sont séparés par électrophorèse sur un gel de polyacrylamide -> repère la position des ddNTP dans la séquence.

Détection des fragments: incorporation de traceurs fluorescents attachés soit à l'oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide.

Principe extraction ADN

Utilisation du kit Qiagen «DNeasy96® Blood & Tissue Kit» en suivant le protocole «Animal tissues» en suivant le protocole «Purification of total DNA from animal tissues (Spin-column protocol)».

Tampon ATL = Tampon ATL est un tampon de lyse tissulaire pour une utilisation dans la purification d'acides nucléiques + Protéinase K = digérer des cellules et d'extraire des acides nucléiques -> coupe les liaisons peptidiques. Incubation de nuit de la plaque (avec agitation)
Tampon AL = tampon de lyse.
Contenue dans Dneasy plaque 96 (colonnes: membranes de silice ayant une forte affinité pour les acides nucléiques) au dessus d’une plaque collectrice (S-block)
Tampon AW1= dénaturer les protéines. 
Tampon AW2 = éliminer les sels de la colonne et aide à purifier l’ADN.
Tampon AE = tampon d'élution pour préparations d'ADN génomique.

Principe extraction ARN

-> Extraction phénolique : elle est utilisée pour débarrasser les acides nucléiques des
protéines car le phénol est un déprotéinisant puissant. Les protéines précipitent, elles sédimentent au fond de la phase aqueuse.
-> Extraction au chloroforme : elle complète toujours l'extraction précédente pour
éliminer toutes traces de phénol aqueux. Toute trace de phénol doit être éliminée pour permettre l’action ultérieure d’enzyme sur l’acide nucléique extrait.

RT-PCR: Reverse Transcriptase Polymerisation Chain Reaction

Détecte qualitativement l'expression du gène par la création d' un ADN complémentaire (ADNc) à partie des ARN transcrits.

RT-PCR utilisée pour cloner des gènes exprimés par transcription inverse de l'ARN d'intérêt.
ARN -> transcriptase inverse -> ADNc
ADNc nouvellement synthétisé est amplifié en utilisant une PCR classique.

Pyroséquençage

Nucléotides ajoutés les uns après les autres -> incorporé dans le brin en cours de synthèse et libère un pyrophosphate.
Une ATP sulfurylase vient alors transformer ce pyrophosphate (PPi) en ATP qui est alors utilisé, couplé à une luciférine, par une luciférase.
On a alors production d’oxyluciférine et d’un signal lumineux (une apyrase dégrade les nucléotides en surplus).

La PCR à émulsion

ADN simple brin -> billes où sont fixées par l’extrémité 5’ des amorces A (billes A) ou B (billes B) complémentaires
de la séquence de l’un ou l’autre des adaptateurs.
Billes -> émulsion contenant les composés nécessaires à la réaction de polymérisation en chaîne ->
individualisation de chaque bille.
Chaque goutte d’émulsion devient un microréacteur dans lequel l’unique fragment d’ADN fixé sur la bille va pouvoir être amplifié.

PCR quantitative

Réaction en chaîne par polymérase permettant de mesurer quantitativement l'amplification d'ADN en utilisant des sondes fluorescentes = mesure le nombre d'amplicon (portion d'ADN définie par un couple d'amorces).

Le séquençage

Le séquençage du mélange -> l’appareil MiSeq Illumina®.

Polymérisation pour le séquençage -> à chaque cycle, ajout d’une base
N cycles = N bases -> séquençage par synthèse
Lecture -> 1 base = 1 couleur -> reconstitution séquence sur flow-cell



Fonction de la rate

La rate est un organe lymphoïde secondaire: participe à la réponse immunitaire.
La rate joue un rôle dans la maturation des globules rouges et dans la purification du sang, par l’élimination des déchets (globules rouges dégradés, virus, bactéries ou débris cellulaires…).

Borrelia

Les borrélies sont un genre (Borrelia) de bactéries spiralées du groupe des spirochètes.

La borrélie : identifiée comme première responsable de la maladie de Lyme, est Borrelia burgdorferi.
Les Borrelia sont des parasites qui utilisent des arthropodes (tiques ou poux) comme vecteurs, mais leur réservoirs biologiques naturels semblent être des micromammifères forestiers, et de grands mammifères tels que les cervidés et les sangliers.

Certaines de ces maladies sont des maladies émergentes ou sont d'intérêt épidémiologique, car posant des problèmes croissants de santé publique.

ARN 16S

Marqueur moléculaire :
• Gène conservé au cours de l’évolution et présent chez tous les procaryotes
Gène codant pour l’ARNr 16S
Taux de sélection des mutations variable enfonction des régions:
– Régions conservées : amorces universelles
– Régions variables : amorces spécifiques
Gène présent chez tous les procaryotes
Taux de mutation variable en fonction des
régions:
– Régions conservées : amorces universelles
– Régions variables : amorces spécifiques
Plus de 200 000 séquences disponibles dans les banques de données (Genbank, EMBL)
• Pb au niveau du nombre de copies : paramètre non constant
• Pb de validité… transfert horizontal?

V4 / V6

Régions variables différents combinés avec des spécificités différentes de l'accompagnement universel? amorces peuvent affecter une analyse de la communauté microbienne basée sur la PCR.

En fonction de la région, il peut être choisi une préférence dans l'amplification de certains genres et / ou la possibilité de manquer la détection d'autres genres de bactéries.

Cleason et al. 2009, ont montré que les régions V4 et V6 ont détecté une plus grande diversité de bactéries, mais le RDP-classificateur a été plus efficace pour la V4 que pour la région V6.

Multiplexage

Le multiplexage est une technique qui consiste à faire passer plusieurs informations à travers un seul support de transmission. Elle permet de partager une même ressource entre plusieurs utilisateurs.

Bromure d’éthidium

Le bromure d'éthidium (abrégé Bet) est un agent intercalant couramment utilisé comme marqueur d'acide nucléique dans les laboratoires de biologie moléculaire.
Lorsqu'il est exposé à des rayonnements ultraviolets, il devient fluorescent.
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