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Enzimas que modificam o DNA

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Ana Roda

on 9 November 2013

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Transcript of Enzimas que modificam o DNA

Enzimas que modificam o DNA
Nucleotidil Transferase
DNA polimerases
Procariotas
DNA polimerase I
- reparação
DNA polimerase II
- proofreading, reinício replicação
DNA polimerase III
- replicação
DNA polimerase IV
- replicação translesão
DNA polimerase V
- replicação translesão
DNA polimerase I
E. Coli - Família A
Termostáveis
UlTma DNA Polimerase
Taq DNA polimerase
Vent DNA polimerase
Deep Vent DNA polimerase
Pfu DNA polimerase


Thermo sequenase DNA polimerase
Variedade e semelhança das DNA polimerases
Atividade polimerase
Atividade 3'-5' exonuclease
Atividade 5'-3' exonuclease
Reações de síntese
Remoção e substituição de primers de RNA
Transcriptase reversa
tRNA funciona como primer e liga-se ao PBS e copia o LTR.
O domínio de RNAse H do enzima degrada o RNA na extremidade acabada de copiar.
O primer “salta” para a extremidade 3’ do genoma viral e reinicia a síntese de DNA pela zona R que reconhece.
Sintetiza a zona U3 que só existe nesta extremidade e continua até ao fim. A primeira cadeia de DNA está completa.
Inicia-se a partir do fragmento de PBS que não foi degradado, sintetizando as zonas LTR.
A cadeia vai à extremidade 3’ e o local PBS serve de reconhecimento e a síntese recomeça desse local. O tRNA solta-se.
Formam-se assim as duas cadeias complementares.
Metilases
7 famílias de DNA polimerases designadas A, B, C, D, X, Y e RT
Atividade
VS Processividade
Atividade
VS "Proofreading"
Nick Translation
Correção de mismatches
"In vitro"
Sequenase:
Substitui fragmento de Klenow
Klenow
30-35 nucleótidos por segundo
Sequenase
300 nucleótidos por segundo
Endo e Exonucleases
Endonucleases
Exonucleases
Degradam sítios específicos do interior da molécula reduzindo-a a fragmentos cada vez mais pequenos.
Degradam fim da molécula.
Remover oligonucleotidos após PCR
Remover DNA cromossonal de preparações de plasmídeos
Remover DNA de preparações de RNA
Análise da Imunoprecipitação da cromatina
1, 4 e 7 -
3 -
5 -
6 -
1 e 2 -
Gerar ssDNA a partir de dsDNA
New England BioLabs
Ilhas CpG
Regiões intergénicas
hipometiladas
hipermetiladas
Eucariotas
DNA polimerase α
5'-3' DNA polimerase dependente de DNA
5'-3' RNA polimerase dependente de DNA - PRIMASE
Sistemas de replicação "in vitro" do vírus símio (SV40) reconstituído
DNA polimerase δ
5’ -3’ DNA polimerase
3' -5' exonuclease
Inibido pelas proteínas RPA
Ligação de RFC (clamp loader)
Agregação de proteínas PCNA
PCNA liga polimerase delta ao template
Mecanismo reparação mismatch
Remoção de um segmento contendo nucleótidos "mismatch"

Re-síntese do segmento
Síntese replicativa ou de transcritos de mRNA em células hospedeiras
DNA polimerase especializada, independente da template
Inserção de nucleótidos modificados;
Produção de homo e heteropolímeros sintéticos;
Marcação (caudas) de homopolímeros de DNA linear de cadeia dupla;
5'-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends);
Localização de apoptose "in situ"
Terminal desoxinucleotidil transferase
Poliadenilação do RNA
Edição de RNA
Reparação de DNA
Remodelação de cromatina
Recombinação somática em células B
Regulação da atividade proteica
Resistência a antibióticos
Sinalização da transdução intracelular
Transferência de NMP de NTP para um grupo hidroxilo aceitador
1000x mais eficiência:
Sequenciação ciclica de DNA
Genotipagem de SNPs (single-nucleotide polymorphism)

DNA metiltransferases (DNMTs)
DNMT1
Metilação que ocorre durante a divisão celular mitótica, copiando o padrão de metilação da fita original.
DNMT2
Parece não apresentar essa atividade, pois está relacionada com a ação metiltransferase de RNA transportador e segundo alguns estudos recentes, a desacetilação de histonas.
DNMT3
Subdividida em A e B, e está relacionada à aquisição de metilação de DNA de novo.
Cinases, fosfatases, acetilases e ligases
Histone Tails
N-terminais
C-terminais
Condensação da cromatina e acessibilidade de proteínas ao DNA
Lisina
acetilada
Diminuição da condensação da cromatina
desacetilada
Condensação da cromatina
histonas acetiltransferases (HATs) histonas desacetilases (HDACs)
metilada
Lys 9 de H3 facilita a metilação do DNA e o silenciamento do gene. Lys 4 de H3 abre a cromatina, ativando a transcrição.
histonas metiltransferases (HATs)
histonas desmetilases (HDMs)

Lisina
Lisina
S-adenosilmetionina
Cinases
Fosfatases
Serina e Treonina
Fosforiladas
Condensação e segregação dos cromossomas, transcrição e reparo de danos ao DNA e activação da apoptose
Ligases
“Ligar” dois fragmentos de DNA fazendo ligações fosfodiéster
Atividade VS Fidelidade
E.coli
Marcação do DNA
Reparação de extremidades 3' e 5' livres para gerar blunt ends
Sequenciação de DNA
T7 DNA polimerase
Atividade polimerase
Atividade 3'-5' exonuclease
1000x maior que o fragmento de Klenow
Purificação de DNA circular fechado covalentemente por remoção de DNA genómico residual
Deteção "in situ" da fragmentação de DNA associada à apoptose
Reações de extenção de primers em templates longos
Extensão em mutagénese dirigida
Aplicações extra
Maior processividade
Melhor estabilidade
Maior atividade específica
Bibliografia
Lewin, B. Genes IX. Porto Alegre, Editora Artes Médicas, 2009. Watson, J. D. et al.
http://www.uenf.br/Uenf/Downloads/LBT_1828_1188851800.pdf, [consultado em 11 de Outubro de 2013]
M., Jonathan - "Replicating DNA with Extraordinary Fidelity: Meet DNA Polymerase" - [online, consultado em 13 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.evolutionnews.org/2013/01/replicating_dna068131.html
http://www.news-medical.net/health/DNA-Polymerase-Families.aspx, [consultado em 13 de Outubro de 2013]
http://www.news-medical.net/health/Prokaryotic-DNA-Polymerases.aspx, [consultado em 13 de Outubro de 2013]
http://www.news-medical.net/health/Eukaryotic-DNA-Polymerases.aspx, [consultado em 13 de Outubro de 2013]
BERMUDEZ, Vladimir P. et all - "Studies on Human DNA Polymerase E and GINS Complex and their Role in DNA Replication", - [online, consultado em 15 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.jbc.org/content/286/33/28963.full.pdf+html
JOHANSSON, Erik et all - "The eukaryotic replicative DNA polymerases take shape", [online, consultado em 15 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968000410000174
COTTERILL, Sue & KEARSEY, Stephen - "Eukaryotic DNA Polymerases", [online, consultado em 15 de Outubro de 2013] disponível em: http://users.ox.ac.uk/~kearsey/reprints/reviews/kearseyR02.pdf
CLINE, Janice et all., - "PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other
thermostable DNA polymerases" - [online, consultado em 18 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC146123/pdf/243546.pdf
FLAMAN, J. M. et all - " A rapid PCR fidelity assay" - [online, consultado em 18 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC310311/
GQ, Shen et all. - "The TaqMan method for SNP genotyping" - [online, consultado em 18 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19768602
http://www.thermoscientificbio.com/dna-and-rna-modifying-enzymes/terminal-deoxynucleotidyl-transferase/, [consultado em 18 de Outubro de 2013]
KUCHTA, Krzysztof et all. - "Comprehensive classification of nucleotidyltransferase fold proteins: identification of novel families and their representatives in human" - [online, consultado em 18 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2794190/pdf/gkp854.pdf
RIGAUD, D. et all. - "Sequenase should be used instead of the Klenow fragment for the synthesis of oligonucleotides labeled to a high specific activity" - [online, consultado em 18 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC328731/
http://www.ebi.ac.uk/QuickGO/GTerm?id=GO:0003887, [consultado em 18 de Outubro de 2013]
PB, Vander Horn, et all, - "Thermo Sequenase DNA polymerase and T. acidophilum pyrophosphatase: new thermostable enzymes for DNA sequencing." - [online, consultado em 19 de Outubro de 2013] disponível em: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC328731/
RT-PCR
A partir do RNA, o TR sintetiza uma cadeia de DNA complementar.
A partir de RNA ou proteínas pode-se obter os genes que os originaram. A cDNA aplica-se PCR.
BIBLIOTECAS DE DNA
Conjunto de sequências genicas de um ser vivo que se expressam numa situação fisiológica específica.
Realiza-se clonagem desses genes.
Essenciais a clonagem!
A ausência de metilação do DNA proporciona uma cromatina com estrutura aberta facilitadora do inicio da transcrição.
Metilação do DNA é uma característica hereditária!
Identifica sequências específicas de DNA ligadas, in vivo, a proteínas de interesse.
AP endonucleases
Reparo do DNA
Cortar a ligação fosfodiester 5’ deixando um 3’-OH livre e um 5’-fosfato de desoxirribose. 
E.coli: endonuclease IV e exonuclease III
Mecanismo de defesa.
Bactérias e Archaea
Produção em laboratório.
Eucariotas: Apenas um tipo de AP endonuclease
Nelson, D. L.; Cox, M. (2008) Lehninger Principles of Biochemistry, 5th ed.; W. H. Freeman: New York.
A.Quintas, A.Ponces Freire, M.J.Halpern, Bioquímica-Organização Molecular da Vida, Lidel 2008.
Lodish, Berk, Kaiser, Krieger, MOLECULAR CELL BIOLOGY, 6th ed.; W.H.Freeman: New York.
Witkowski, Jan; Zoller, Mark, Recombinant DNA, 2nd ed; W.H.Freeman: New York
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https://www.neb.com/tools-and-resources/selection-charts/common-applications-for-exonucleases-and-endonucleases (consultado a 17 de Outubro)
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http://www.dr-addie.com/Portuguese/rtpcr.html (consultado a 13 de Outubro)
http://molbioandbiotech.wordpress.com/2007/10/26/retrotransposons-and-retroposons-subtle-nuances/
http://www.clearscience.info/animations.html
http://proteopedia.org/wiki/index.php/Transcription_and_RNA_Processing
http://www.dnaftb.org/25/problem.html
http://www.web-books.com/MoBio/Free/Ch4J1.htm
http://www.bvsam.icict.fiocruz.br/teses/mlfwerner.pdf
http://rt-pcr-e-hiv.blogspot.pt/2012/06/mecanismo-de-acao-da-transcriptase.html
http://www.revistademedicina.org.br/ant/90-1/5-Cesar%20Isaac.pdf
Dias Correia, J.H.R.; Dias Correia, AA. Epigenética nos Animais
Ministério da agricultura, Pecuária e Abastecimento; Engenharia Genética: conceitos básicos, ferramentas e aplicações; Maio 2013




FACULDADE DE CIÊNCIAS DA UNIVERSIDADE DE LISBOA
Biologia Molecular; 2013
Docentes: Margarida Amaral e Luka Clarke
Ana Raquel Maia, nº41886
Ana Sofia Roda, nº41876
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