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Producción Industrial de Vitaminas, Aminoácidos y Nucleótidos

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amaya velazco

on 21 September 2016

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Producción Industrial de
Vitaminas, Aminoácidos y Nucleótidos

Vitaminas
Hay tres vías de síntesis:
1.
Síntesis química completa.
2.
Síntesis mixta (el más usado), usando
Bacillus subtilis
como productor de ribosa, que se transforma químicamente en riboflavina.
3
. Síntesis microbiana.
a.
Con
Ashbya gossypii
(hongo), usando aceite de soja o maíz complementados con glicina y purinas (estimulan la producción). Es la más tradicional, con rendimientos de
6-7 g/L.
b.
Con otros microorganismos (
Candida flareri, Saccharomyces cerevisiae o Bacillus subtilis
), se adaptan a una fuente de carbono concreta, con lo que los procesos se hacen muy específicos, y la producción es muy variable (de 21 g/L de
Candida
a 4.5 g/L de
Bacillus
).
Nucleótidos
Productos intermedios del metabolismo Primarios

Estas son factores de crecimiento que se utilizan o se adicionan a los alimentos.
Varias vitaminas, aminoácidos y nucleótidos de gran importancia se producen a nivel comercial mediante procesos microbiológicos.
Los procesos de obtención son aerobios y la formación de estos productos ocurre principalmente en microorganismos sometidos a mutaciones o que se los hace crecer en medios deficientes. En cualquier caso lo que se pretende es lograr una Regulación anormal del metabolismo tal que la fuente de carbono y energía de derive a hacia la formación del producto deseado.

Aminoácidos
La producción de vitaminas ocupa el segundo lugar, después de los antibióticos. La mayor parte de las vitaminas se fabrican comercialmente por síntesis química.
Sólo existen 3 vitaminas diferentes, B12, vitamina c y riboflavina, que se producen mediante métodos microbiológicos a escala industrial, porque la extracción de vitaminas de productos ricos o la síntesis química suelen ser métodos más baratos.
Regulación de la Biosíntesis

Como lo microorganismos utilizan los aminoácidos como bloques de construcción de las proteínas, se efectúa una regulación estricta de la producción de aminoácidos.

El papel del microbiólogo industrial es encontrar formas para desviar los mecanismos reguladores microbianos.
La biosíntesis de cada uno de los aminoácidos comprende varias etapas. Se ha determinado mediante estudios que la primera etapa enzimática suele estar sometida a inhibición por retroalimentación por el producto final de esta vía.
Una forma de lograr una sobreproducción de un determinado aminoácido es obtener un mutante en la cual la primera enzima única en esa vía del aminoácido ya no esté sometida a la inhibición por retroalimentación. Esto se puede lograr aislando un mutante resistente a un análogo del aminoácido.



Un factor muy importante, para lograr un proceso comercial, es conseguir la excreción del aminoácido al medio de cultivo. En general, los organismos no excretan los metabolitos indispensables como los aminoácidos. Se realiza un ajuste de la excreción.
Un procedimiento interesante para obtener un nivel elevado de excreción de un aminoácido es el que se utiliza para la producción del ácido glutámico.


Ácido glutámico
La producción y excreción del exceso de ácido glutámico depende de la permeabilidad celular.
Proceso de Producción:
1.
El organismo productor del ácido glutámico,
Corynecbacterium glutamicum y Brevibacterium flavum
usando glucosa y sacarosa como fuente de carbono.
2
.
Corynecbacterium glutamicum
es incapaz de completar el ciclo de kreps, lo que supone que muchos de los productos que de él se derivan sigue otras rutas alternativas y así se acumula ácido αalfa-cetoglutárico. Debido a su similitud estructural, se transforma fácilmente en ácido glutámico, precursor del glutamato.
3.
Se facilita la excreción de ácido glutámico por adición de biotina al medio, con lo que se puede extraer el ác. glutámico y purificar.
4
. El proceso se realiza en discontinuo, a 38*C y pH de 7,8. Con una duración de 30-35 horas se obtienen del orden de 100 g/L.

Biotina, factor indispensable en la síntesis de ácidos grasos. La deficiencia en biotina daña la membrana celular (como resultado de una producción deficiente de fosfolípidos) y bajo estas condiciones se excreta ácido glutámico intracelular.
El medio empleado para producción comercial de ácido glutámico contiene suficiente biotina para obtener un buen desarrollo y la deficiencia en biotina asegura la excreción del ácido glutámico.
La Lisina
Para la obtención de la lisina se emplea cepas de
Corynebacterium glutamicum
que carece de la enzima Homoserina deshidrogenasa, de este modo resulta ser auxotrofo para metionina y treonina. Además la enzima dehidroxipicolinato sintetasa no es inhibida por la lisina. Ésta conjuntamente con la treonina ejerce inhibición concentrada sobre la Aspartatoquinasa de modo tal que aún en este mutante no se acumulará lisina si en el medio de cultivo hay treonina libre.

La lisina también es producto de la bacteria Brevibacterium flavum, y se utiliza como aditivo alimentario.

La estrategia para obtener lisina consiste en realizar el cultivo en condiciones tales que la concentración de treonina libre sea mínima, lo cual se consigue alimentando el cultivo con este aminoácido y tratando de mantener su concentración en valores muy pequeños. Así se evita la retroinhibición sobre la dihidroxipicolinato sintetasa y se acumula la lisina en el medio de cultivo. Por cada mol formado se forman 4 de NADH y se consume 1 de ATP, por lo que la formación de lisina está asociada la formación de ATP.
Aunque el ácido glutámico es un constituyente de toda proteína común, el recurso común es el gluten de maíz y trigo.
Los pasos básicos para producir MSG son:
(1) concentración y colección de melaza filtrada.
(2) su hidrólisis, usualmente con ceniza de sosa.
(3) neutralización y acidificación de hidrolisato.
(4) remoción parcial de sales inorgánicas y
(5) cristalización, separación y purificación del MSG.
PLANTA DE PRODUCCIÓN DE MONOSODIO GLUTAMÁTICO (MSG)
Riboflavina (B2)
Originalmente la fermentación utilizaba un medio con glucosa y líquido de maceración de maíz. Cuando se utilizaron lípidos como fuente de energía, el rendimiento aumentó marcadamente. Actualmente se utiliza el siguiente medio:

· Líquido de maceración de maiz al 2,25%
· Peptona al 3,5%
· Aceite de soja al 4,5%

Así mismo para obtener altos rendimientos es crítico el uso de inóculos pequeños (0,75-2%) de un cultivo de 24-48h que crezca activamente. La fermentación dura 7 días con una velocidad de aireación de 0,3 vvm a 28°C.

La riboflavina está presente en el caldo de fermentación tanto en solución como unida al micelio. La vitamina unida al micelio se libera de las células por tratamiento con calor (1 hora, 120°C) y el micelio se separa y se elimina.
Cobalamina (B12)
Sólo se obtiene por vía microbiana, ya que la síntesis química es muy compleja y poco rentable.
Químicamente, la formas activa es la cianocobalamina.
1. Propionibacterium: (P. freudenreichii y P. shermanii)
a. Primera fase:
anaeróbica. En ella se sintetizan los precursores de la vitamina.
b. Segunda fase:
aeróbica. En ella se sintetiza la cobalamina siempre que se aplique el adecuado tratamiento térmico en presencia de cianuro.
La producción de vitamina oscila cerca de los 25 mg por litro de medio de cultivo.
2. Pseudomonas denitrificans.

Se obtiene el mayor rendimiento es de 70 – 80 mg/l. Sin embargo, está sujeto a patentes, por lo que no es rentable.
3.
Bacillus megaterium
, en experimentación.
Ácido ascórbico (C)
La síntesis más usada es:
1.
La glucosa se convierte químicamente en sorbitol.
2.
El sorbitol es transformado en sorbosa por acción del
Acetobacter suboxydans.
3.
La sorbosa es modificada químicamente hasta obtener ácido ascórbico.
Hay microorganismos capaces de sintetizar la vitamina completamente (el alga
Chlorella pyrenoidosa
y la levadura
Candida norvegensis)
, pero son menos rentables que los procesos químicos.


Los nucleótidos son productos muy usados en la industria alimentaria. Se usan principalmente como saborizantes. A principios del siglo XX, en Japón se dieron cuenta de que los ingredientes activos de todos los productos saborizantes que usaban eran Glutamato, Lisina o nucleótidos monofosfato de purinas
( 5’-IMP, 5’-GMP), por lo que desarrollaron sistemas de producción
Hidrólisis enzimática del ARN
Es la más utilizada, sobre todo en Japón.
Se usan levaduras con alto contenido en ARN, que se cultivan hasta el final de la fase logarítmica de crecimiento (principio de la fase estacionaria), ya que entonces detienen la biosíntesis estructural. Las cepas usadas son principalmente

Candida utilis
o

Saccharomyces cerevisiae
.
Proceso:
Se extrae el ARN usando agua caliente de pH alto (con lo que el ARN pasa a la disolución), y posterior adición de HCl (preferentemente) o etanol, lo que provoca la precipitación de este ARN.
Se deshidrata el producto.
Se produce la hidrólisis enzimática, con lo que tenemos los nucleótidos sueltos en disolución.
Adicionamos carbón activo, con lo que se adsorben sobre éste.
Por elución selectiva con una solución de metanol-amonio, eliminamos los nucleótidos pirimidínicos, con lo que nos quedamos con AMP y GMP.
El GMP es producto, y el AMP se desamina por cultivo con
Aspergillus oryzae,
con lo que se obtiene IMP (inosin-mono-fosfato).
Se separan los nucleótidos por cromatografía de intercambio iónico.
Hidrólisis química del ARN
El ARN se obtiene igual que en la hidrólisis enzimática.
Se degrada el ARN hasta obtener los nucleótidos mediante Ca(OH)2 y 130*C durante 3-4 horas.
El resto del proceso es similar, con la salvedad de que es preciso efectuar una fosforilación posterior.
Fermentación del IMP
Se produce la inosina usando auxotrofos de
Bacillus subtilis, Brevibacterium ammoniagenes
y
Microbacterium
que tienen bloqueada la síntesis de nucleótidos.
Este proceso es de un alto rendimiento (se obtienen
30-35 g/L). El hecho de usar auxotrofos que sólo sintetizan inosina es para evitar la regulación por producto final.
La inosina producida se somete a pH básico (aprox. 11), con lo que precipita y cristaliza.
Se produce la fosforilación, con lo que se obtiene el IMP.
Fermentación del GMP
Síntesis indirecta
Se obtiene AICAR (5-amino-4-imidazol carboxamida ribosa) con cepas auxotrofas para la purina y mutadas en determinadas actividades enzimáticas (lo que facilita la acumulación sin inhibición).
Se favorece la excreción del AICAR (intracelular) al caldo fermentativo:
• Adición de una fuente de purina, lo que permite que se siga sintetizando AICAR hasta que la célula lo va expulsando por exceso.
• Adición de un inhibidor ante la esporulación (como ácido butírico o reducción del oxígeno, que
evita un rápido agotamiento de los nutrientes, por lo que evita la esporulación).
Síntesis directa
Es el menos usado.
Se usan mutantes de
Bacillus subtilis
en los que se ha aumentado el número de copias del gen que codifica la enzima del paso limitante de la ruta de producción de guanosina (con lo que aumenta el número de enzimas del proceso y la producción aumenta).
Se obtiene guanosina, lista para el consumo tras fosforilarla.
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