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EVALUACIÓN DE LA SEPARACIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO OBTENIDO A PART

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on 30 October 2014

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EVALUACIÓN DE LA SEPARACIÓN DE ÁCIDO LÁCTICO OBTENIDO A PARTIR DE RESIDUOS DE PIÑA Y BACTERIAS ACIDOLÁCTICAS
Juan Camilo Cuellar Oviedo
Director: Adriana Inés Páez Morales M.Sc.
31 de octubre de 2014
Justificación
Objetivos
Metodología
Resultados
-¿Porque se realiza?
-Generalidades
-Objetivo general
-Objetivos específicos
- Planteamiento de los pasos de recolección y análisis de datos
- Resultados obtenidos en la fase experimental
- Especificación de los requerimientos técnicos
OBJETIVO GENERAL


Evaluar la separación de ácido láctico proveniente de la fermentación de residuos de piña por métodos físicos con la bacteria
Lactobacillus acidophilus
.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS


- Obtener ácido láctico por medio de una fermentación sobre el sustrato de piña con
Lactobacillus acidophilus
.

- Seleccionar una alternativa de separación líquido-líquido de ácido láctico por medio de un desarrollo experimental.

- Establecer los requerimientos técnicos de la alternativa que muestre mayor rendimiento.

Obtención por fermentación de ácido láctico
Separación líquido-líquido
Determinación de ácido láctico por HPLC
- Activación de la cepa
- Preparación del medio
- Fermentación
- Selección del solvente
- Procedimiento de extracción
Porque?
Esta trabajo se lleva a cabo gracias al semillero de investigación de Biotecnología BIOTECFUA de la Fundación Universidad de América, la cual ha desarrollado e incentivado el estudio de la obtención de ácido láctico, por medio de dos proyectos de grado, los cuales se encargan de la obtención y separación del ácido láctico a partir del proyecto titulado: “Evaluación de la producción de ácido láctico a partir de piña (Ananas comosus Merr) y banano (musa sapientum) como materia prima para la síntesis de ácido poli láctico”.
Antecedente
En el año 2013 Laura Gillén Romero y Jorge Vega lópez presentan una tesis para obtener el título de ingeniero químico titulada "Evaluación de la producción de ácido láctico a partir de piña (Ananas comosus Merr) y banano (musa sapientum) como materia prima para la síntesis de ácido poli láctico”. El cual se encargó de obtener el ácido láctico a partir de residuos de piña y banano, a partir de
Lactobacillus acidophilus,
evaluando factores como cinética de reacción, temperaturas óptimas de crecimiento, condiciones de fermentación , entre otros.

Se toma un sobre de
Lactobacillus acidophilus
, que contiene 5 dosis, en la cual cada dosis equivale a 1011 UFC/mL, se agrega todo el contenido al caldo de cultivo previamente esterilizado bajo condiciones asépticas. Según lo reportado por María Orozco et all y Laura Guillen et all .
- Se usa una piña con alto grado de maduración (entre 15 y 16 días).

- Volumen elegido de 1000 mL de solución a una proporción de 25% sustrato y 75% solvente, según o reportado por Laura Guillen et all.

-Con el fin de que la solución sea homogénea y la interacción microorganismo-sustrato esté presente se prepara el caldo de cultivo con un volumen de 250 mL de sustrato debidamente colado, y se completa con 750 mL de agua.

- Se realiza la respectiva esterilización a 121 ºC y 15 lbs de presión según lo reportado por Carla Araya-Coutier et all.
Se establecen varias características para realizar la selección del solvente.

- Su polaridad: que sean polares próticos, apróticos y no polares.

- Su punto de ebullición.

- Su constante dieléctrica.

- Su densidad.

- Su solubilidad.

- Su volatilidad.
Se utiliza éter dietílico, acetato de etilo, y n-butanol, para realizar la extracción a 25°C y 1 atm.

Se realizan los ensayos de extracción en embudos de decantación de 25 mL, con 10 mL de solvente y 10 mL de medio de fermentación.

Se utiliza una incubadora tipo Shacker con una velocidad de agitación de 500 rpm. Metodología estipulada por Sanchez N et all y Liliana Serna et all.

Leer las concentraciones por medio de cromatografía líquida de alta eficiencia (HPLC), para encontrar el punto donde se llega a un aparente equilibrio, establecer que solvente genera mayor rendimiento en la extracción.
Centrifugación: Luego de la biotransformación del medio de cultivo se toman 6 tubos tipo falcon para centrífuga, se completan hasta un volumen igual a 50 mL y se centrifugan por 10 minutos a 5000 rpm, especificaciones ya estipuladas por Liliana Serna et all.
Filtración: La etapa de filtración se realiza en un embudo y papel filtro
Microfiltración al vacío: La micro filtración al vacío se usa para eliminar partículas mayores o iguales a 0,45 micrómetros, este paso incluye remoción de microorganismos.Se usan filtros esteriles de marca Millipore y una bomba para generar vacío, ya que sin esta no será posible que se genere la filtración, metodología sugerida por Gil Horán et all .
Concentración: La concentración se realiza para reducir la cantidad de agua que pueda interferir en la fase de extracción líquido-líquido. La solución contenida no debe llegar al punto de ebullición a presión del ambiente debido a que la molécula de ácido láctico presenta desnaturalización y/o transformación por acción de temperaturas elevadas, haciendo de la separación por destilación convencional un proceso ineficiente. La temperatura en el rotaevaporador debe ser especificada a 40ºC, la presión debe estar en 72 mbar y la velocidad de rotación de 95 rpm. Al mismo tiempo el vapor de agua se separa continuamente en el condensador alcanzando una temperatura de 58 ºC a 60 ºC.
Adsorción: Se evalúa si es necesario utilizar el pretratamiento como paso anterior a la extracción de ácido láctico por medio de solventes para el acondicionamiento de la muestra en el proceso propuesto. El uso de carbón activado es apropiado como material adsorbente, ya que es un material que no involucra altos costos de separación u operación. Se toman 20 mL de muestra concentrada y se pone en contacto con 1g de carbón activado, cantidad que se encuentra en el rango de 0.1 a 0.5% en peso con respecto a la muestra líquida, según lo reporta Sandra Rodriguez et all
Extracción líquido-líquido:

Se ponen en contacto 10 mL de solución acuosa y 10 mL de solvente en un montaje compuesto por un soporte universal y un embudo de 25 mL.Debe estar en constante agitación, metodología sugerida por por Yeimi Mesa. El tiempo de mezclado es reportado por varios autores y se estipula que 45 minutos son suficientes para que se llegue a un aparente equilibrio, es decir que la transferencia de masa de la fase acuosa a la fase orgánica se reduce significativamente, este tiempo es seleccionado debido a estudios preliminares realizados por Yeimi Mesa y Kanungnit Chawong et all .

- Etiquetado de muestras
- Especificación de la columna
- Análisis de muestra patrón
- Ingreso y análisis de muestras a cuantificar
Conclusiones
- Se obtiene ácido láctico con una concentración de 384 mM transcurridas 108 horas de fermentación con sustrato de piña y bacterias
Lactobacillus acidophilus
, corroborandose la cinética estipulada y mencionada en la metodología.
- La alternativa que arroja mayores resultados en la fase de la extracción líquido-líquido es el uso de n-butanol como solvente extractante, potencial de hidrogeno de 0.55 y relación en volumen de 1:3. Pero se especifíca como más conveniente para este proceso la de potencial de hidrógeno de 0.55 y relación en volumen de 1:1 debido al gasto de energía a la hora de recuperar el solvente
- Se obtienen 887.6 mL de ácido láctico de una solución inicial de 20000 mL, existiendo pérdidas de ácido láctico en la centrifugación, filtración, microfiltración, adsorción y en la extracción
- La eficiencia esta estrictamente ligada con el coeficiente de distribución, por lo cual tiende a aumentar con la disminución del pH, el aumento de la relación en volumen entre las fases y la selección de un solvente extractante con una gran afinidad hacía el ácido láctico. A tiempo de extracción y concentración inicial del caldo biotransformado constantes, la disminución del pH y el aumento de la relación en volumen producen un incremento del ácido láctico obtenido llegando a una eficiencia máxima de 57.174 % y coeficiente de distribución de 0.3963.
- Las sales, azucares residuales y demás impurezas generan una barrera que evita la transferencia de masa de la fase acuosa a la fase orgánica, por eso es necesario implementar un paso de adsorción para remover estas impurezas antes que comience la fase de extracción.
BIBLIOGRAFÍA
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ARAYA-CLOUTIER, Carla. ROJAS, Carolina. Síntesis de ácido láctico, a través de la hidrólisis enzimática simultanea a la fermentación de un medio a base de un desecho de piña (Ananas Comosus), para su uso como materia prima en la elaboración de ácido poliláctico. Revista Iberoamericana de polímeros. Vol 11.; No 7 (Diciembre. 2010); p 407-416.

BOUCHOX, Antoine. Investigation of nanofiltration as a purification step for lactic ácid production processes based on conventional and bipolar electrodialysis operations. Génie chimique. Vol 1.; No 2 (Ago. 2000) p. 266-273.

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Se usa una columna de intercambio marca Shodex SH1011. Dentro de las aplicaciones de la columna se encuentra el análisis de ácido láctico y leche fermentada
Teniendo especificada la columna se procede a realizar el análisis de una muestra patrón con una concentración conocida para corroborar que el cromatografo funciona en correctas condiciones y está totalmente adecuado para comenzar a correr las muestras, metodología verificada y estipulada por Shweta Kamble . La concentración de la muestra patrón contenida en un volumen de 25 mL
Se introduce 1ml de cada muestra a analizar en viales, para luego ser llevados a la bandeja del inyector automatico SIL-20A y por medio del software seleccionar las muestra a analizar.

Se usa el modo de gradiente para la identificación cuantitativa de las muestras, para realizar las cromatografías por este método es necesario cerciorase que el equipo en su conjunto sea capaz de realizar mezclas de disolventes con un control preciso y reproducible. Con este método se habilitan todas las líneas de flujo de solvente, que en este caso y para la columna es agua tipo Milli-Q, la cual ha sido filtrada y purificada por medio de osmosis inversa. Los busos de entrada para la fase móvil son limpiados por medio del uso de un sonicador en una solución acuosa de ácido sulfúrico para eliminar las impurezas y restos de la fase móvil usada en el anterior proceso cromatográfico, procedimiento corroborado por Andrea Iñiguez et all .
Diagrama general para realizar análisis cuantitativo por medio de HPLC
Recomendaciones
- Realizar el proceso de adsorción como primera operación luego de la filtración al vacío mejorará notablemente la eficiencia del proceso de extracción líquido-líquido.

- Se recomienda realizar el análisis cuantitativo de las muestras inmediatamente después de terminados todos los pasos propuestos para que no exista desnaturalización, autoesterificación u otro problema que pueda alterar la lectura real. A demás, se recomienda realizar pruebas para verificar la existencia de proteínas, azucares residuales, iones y microorganismos para determinar si el producto es apto para el consumo humano o útil como materia prima en algún sector de la industria.

- Se recomienda examinar, purgar y limpiar debidamente la columna de intercambio iónico usada en la técnica de cromatografía, porque debido a su sensibilidad se pueden realizar lecturas erróneas causadas por iones o microorganismos albergados en la misma.

- Se recomienda realizar pasos de optimización en cada una de las operaciones unitarias propuestas para alcanzar mayores rendimientos.

- Se recomienda evaluar técnicas de separación no convencionales, para ser aplicadas a sustratos complejos, tal como lo es la piña.

Proceso propuesto
Equipo de filtración
Equipo de clarificación
Equipo para realizar la concentración
Especificaciones del equipo de concentración
Equipo de adsorción
Equipo de extracción
Especificaciones del equipo de extracción (Mezclador/decantador)
Ventajas y desventajas del equipo de filtración
Ventajas y desventajas del equipo clarificador
Diagrama de proceso
Obtención de ácido láctico
- Caldo de cultivo con un pH de 2,5
- Reducción de volumen a 945 mL
- Proteínas, ésteres, color, ácidos orgánicos secundarios, cationes Ca+2 y NH4+1 y aniones CO3-2 y SO4-2
- Así mismo el producto sólido obtenido presenta una gran cantidad de azúcares no consumidos, identificados principalmente como glucosa y xilosa
- Tiempo de retención 9,093 minutos
Curva de calibración de ácido láctico
Cromatograma obtención de ácido láctico
Separación de ácido láctico por medio de extracción líquido-líquido
- El volumen luego de la microfiltración es de 758 mL
- El volumen luego de la concentración es de 385 mL, eliminando en el evaporador al vacío gran cantidad de agua e impurezas con un punto de ebullición cercano al del agua.
Adsorción
Especificaciones y resultado de la extracción a pH 2,5 y relación en volumen de 1:1
Según los resultados el solvente que arroja mayores rendimientos es el éter, pero esto se debe a la volatilidad que tiene esta sustancia con respecto a las demás fases orgánicas estudiadas y el lapso de tiempo entre la finalización de la prueba y la realización de los análisis cuantitativos, factor fundamental a la hora de obtener resultados más acertados
Especificaciones y resultados de la extracción a pH variable y relación en volumen de 1:1
Especificaciones y resultados de la extracción a pH bajo y relación en volumen variable
Determinación de ácido láctico por HPLC
Concentraciones de ácido láctico en cada muestra procesada
Aplicaciones
Situación en Colombia

En Colombia existe un estimado de producción de piña de 416´660.000 toneladas en el año 2011 según FAO (Food And Agriculture Organization), además la demanda de piña va en aumento, por esta razón existen grandes volúmenes de desechos sólidos (cascaras), de esta fruta.

Puede producirse por biotransformación (biorreacción) o síntesis química. La síntesis química requiere de costosos y complejos procedimientos de obtención y separación para lograr la pureza deseada del producto final.

La demanda ha venido aumentando con un incremento del 5 al 8% anual, según Purac. "Lactic acid. Technical Report". Especialmente debido al desarrollo de los polilactatos (PLA), por lo que hoy en día solamente el ácido L(+) láctico es el de mayor importancia comercial.


El problema no radica en la obtención de este ácido sino en su respectiva separación y purificación para cumplir con las especificaciones para su posterior uso en la industrias, debido a la gran solubilidad del ácido en agua, a su baja volatilidad y a la presencia de dos enantiómeros L(+) y D(-), además de la forma LD.

Debido a que muchas técnicas son costosas, se busca implementar una que sea de bajo costo.

Se plantea evaluar el rendimiento para la técnica seleccionada (Extracción líquido-líquido).
Problema general de investigación
Condiciones de operación

- T= 36 ºC
- Velocidad de agitación = 150 rpm
- Duración = 108 horas
- Característica: anaerobea facultativa
- El tiempo de fermentación se elige basado en la cinética de la reacción estipulada por Laura Guillén et all , dando rendimiento apropiado en la hora 108

pH
D
D
pH
Bacterias Gram Positivas vistas al microscopio
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