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Tesina 2013

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by

Marilina Raices

on 1 October 2016

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Transcript of Tesina 2013

Determinar los efectos de la concentración de 10mM de BrdU sobre los distintos tipos celulares presentes en el EO de larvas de anfibio

(2007) Quick y Serrano
Autora: Marilina Raices
Directora: Dra. Andrea Gabriela Pozzi
Alcances y limitaciones del uso de BrdU para el estudio de neurogénesis olfatoria en larvas de anfibios
El sistema Olfatorio
Reiss y Eisthen. (2008) Sensory evolution on the threshold. Adaptations in secondarily aquatic vertebrate Ed. University of California Press
El epitelio olfatorio (EO)
Epitelio Pseuestratificado
Tres tipos celulares:

Las células sustentaculares (CS) o de sostén

Las neuronas receptoras olfatorias (NRO)

Las células basales (CB) o progenitoras
Neuronas Receptoras Olfatorias
Morfología bipolar

Sus cuerpos celulares se ubican en la zona intermedia del EO, entre las capas de las CBs las CS

Dirigen sus procesos axónicos hacia el BOP.

Son las únicas neuronas que se encuentran en contacto directo con el ambiente externo

Células Sustentaculares
El cuerpo de estas células se ubica en la región más apical del EO

Presentan numerosas microvellosidades que proyectan hacia el lumen nasal

Cumplen importantes funciones :

1) proporcionan un sostén estructural

2) contienen gránulos secretorios que liberan un mucus sobre
la superficie del EO
Células Basales
Células pluripotentes que dan origen a las células del EO

Se ubican cerca de la membrana basal

Dos tipos descritos en murinos: las células basales horizontales (CBH) y las células basales globosas (CBG)

Neurogénesis Olfatoria
Técnicas para el análisis de neurogénesis
Autorradiografía con Timidina tritiada
Timidina marcada radioactivamente

Se incorpora al ADN de células en fase S de la mitosis

Se las distingue del resto por su radioactividad

Incorporación de BrdU (Bromodeoxiuridina)
Nucleótido sintético

Análogo a la timidina

Se incorpora al ADN de células en fase S de la mitosis
La incorporación de BrdU puede ser detectada utilizando anticuerpos específicos.



Beites CL, Kawauchi S, Crocker CE, Calof AL. (2005) Identification and molecular regulation of neural stem cells in the olfactory epithelium. Exp Cell Res. Jun 10;306(2):309-16.
Fletcher RB, Prasol MS, Estrada J, Baudhuin A, Vranizan K, Choi YG, Ngai J. p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.Neuron. 2011 Dec 8;72(5):748-59.
(2010) Kondo et al.: inyección de BrdU en ratones postnatales

Estudios recientes han reportado que el BrdU puede presentar
efectos nocivos
, ya que puede :

actuar como un agente mutagénico

retrasar el ciclo celular

alterar la estabilidad del ADN

desencadenar la muerte celular


Primer objetivo
Analizar la dinámica de proliferación y diferenciación celular en el EO en larvas de anfibios, estableciendo las características del recambio de NRO
3hs
24hs
72hs
Se fijaron las larvas
Se realizaron cortes histológicos
Mediante inmunofluorescencia se intentó colocalizar BrdU y OMP (marcador de neuronas maduras)
OMP
BrdU

OMP
NCAM
GOLF
GAP-43
Fletcher RB, Prasol MS, Estrada J, Baudhuin A, Vranizan K, Choi YG, Ngai J.
p63 regulates olfactory stem cell self-renewal and differentiation.Neuron. 2011 Dec 8;72(5):748-59.
Objetivo general:

Analizar la validez y limitaciones de la técnica de BrdU para estudios de proliferación y diferenciación neuronal en EO de larvas de anfibio.

Tratamiento con 10mM de BrdU
Semicuantificación de OMP por WB
Semicuantificación del ARNm de Golf por PCR
Efecto sobre las NRO
WB
PCR
72hs
post-tratamiento
14 larvas tratadas y 14 larvas control
Disección de EO
Extracción de proteínas
Western Blot para OMP
72hs
post-tratamiento
4 larvas tratadas y 4 larvas control
Disección del EO
Extracción de ARNm
PCR para Golf
Western Blot - OMP
10mM de BrdU
PCR Semicuantitativa-Golf
10mM BrdU
Disminución en la expresión de Golf para los animales tratados
La tendencia indica una caída en la expresión de OMP
EFECTOS SOBRE lAS NRO
Caída en la inmunomarca de OMP

Caída en la expresión proteica de OMP

Caída en la expresión de ARNm de Golf
El BrdU provoca la muerte de las NRO
10mM BrdU
Tratamiento con 10mM de BrdU
Efecto sobre los niveles de muerte celular
IHQ para Caspasa 3 activada
TUNEL
OxyBlot
(Proteínas Oxidadas)
Caspasa 3 activada
10mM BrdU
Extracción de oocitos de ovisaco
Extracción de testiculos de cavidad abdominal
Fecundación de oocitos con macerado de testículos
Decae la inmunomarca de OMP
Incremento en las células que mueren por apoptosis
TUNEL
10mM BrdU
Aumento de células apoptóticas
OxyBlot
10mM BrdU
Incremento de proteínas oxidadas
10mM BrdU
Caspasa 3 activada
TUNEL
Proteínas Oxidadas
Apoptosis
Efecto sobre las CS
10mM BrdU
Sumergieron larvas de de distintos estadios en soluciones de BrdU
Citoqueratina II
Alcian Blue
Tratamiento con 10mM de BrdU
IHQ para Citoqueratina II
Coloración con Alcian Blue
Efecto sobre las CS
Citoqueratina II
10mM BrdU
Decae la marca
Alcian Blue
10mM BrdU
Compactación de vesículas en la zona más apical del EO
Determinar los efectos de la concentración de 10mM de BrdU sobre los distintos tipos celulares presentes en el EO de larvas de anfibio
.
NRO
OMP
Golf
CS
Citoqueratina II
Alcian Blue
Apoptosis
Concentración de vesiculas secretoras en la zona más apical del EO (3hs post-tratamiento)
Caspasa 3 activada
TUNEL

Analizar si es posible el uso de concentraciones menores de BrdU para el estudio de proliferación y diferenciación celular en EO a fin de minimizar los efectos nocivos sin perder su propiedad de marcador de proliferación celular
.
1hs post-tratamiento
45´
Efecto sobre las NRO
1mM BrdU
OMP
BrdU
No decae la inmuno marca de OMP
10mM BrdU
OMP
BrdU

Decae la inmunomarca de OMP
10mM BrdU
WB para OMP
1mM BrdU
Expresión proteica de OMP similar al control
PCR Semicuantitativa-Golf
1mM BrdU
Expresión génica de Golf similar al control
EFECTOS SOBRE lAS NRO
1mM BrdU
1mM BrdU
Efectos sobre la muerte celular
Caspasa 3 activada
Aumento de células apoptóticas a las 24 hs
TUNEL
1mM BrdU
OxyBlot
1mM BrdU
Aumento de proteínas oxidadas
1mM BrdU
Caspasa 3 activada
Proteínas Oxidadas
Apoptosis
Efecto sobre las CS
1mM BrdU
Citoqueratina II
Disminuye la marca en las proyecciones citoplasmáticas
Alcian Blue
1mM BrdU
Compactación de vesículas en la zona más apical del EO
10mM BrdU
NRO
OMP
Golf
CS
Citoqueratina II
Alcian Blue
Apoptosis
Concentración de vesiculas secretoras en la zona más apical del EO (3hs post-tratamiento)
Caspasa 3 activada
Uso de 1mM BrdU para estudios de neurogénesis
1mM BrdU
1mM BrdU
OMP
NCAM
GAP-43
GAP-43
1mM BrdU
Gap-43
BrdU
NCAM
1mM BrdU
NCAM
BrdU
BrdU y NCAM NO COLOCALIZAN
OMP
1mM BrdU
OMP
BrdU
30 días
BrdU y OMP
NO COLOCALIZAN
45´
Director asistente: Lucas David Jungblut
Lugar de trabajo: Laboratorio de Biología del Desarrollo – DBBE- IFIByNE - FCEyN – UBA-CONICET
Efecto sobre el estado oxidativo de las células

Desbalance en la capacidad antioxidante de las células
Estado oxidativo
Proteínas oxidadas
Desbalance en la capacidad antioxidante de las células
Estado oxidativo
Proteínas oxidadas
Conclusiones
Cambios cronológicos en las células marcadas dentro del EO
(2011) D´Amico et al.: inyecciones ip de BrdU en juveniles y adultos de

• El BrdU posee efectos adversos a distintos niveles (estructurales y fisiológicos) en todos los componentes celulares del EO
• El BrdU actuaría a dos niveles dentro del EO:
1) En las células que lo incorporan: ingresando a las células en división y afectando la diferenciación y maduración de las mismas
2) En otros tipos celulares del EO que entran en contacto con el BrdU pero que no lo incorporaron en su ADN
BrdU colocaliza con marcadores de diferenciación
tempranos
(GAP-43), evidencia de que las células comienzan un camino de diferenciación neuronal
Las células comenzarían un camino de diferenciación neuronal que luego se frena y no llega a término
Control
3hs

Ventajas:


Resultados mucho más rápidos

No se manipula material radioactivo

¡Muchas gracias!
Objetivo 1:
Objetivo 2:
(2010) Jungblut et al.
Sumergieron larvas de en BrdU durante 30´.
Xenopus laevis
Origen, comportamiento migratorio y patrones de diferenciación celular en cerebro
Rhinella

arenarum

Luego de
30´
de tratamiento se sacrificaron las larvas y analizaron
proliferación
en el oído interno mediante IHQ
(2007) Quick y Serrano
30´
Luego de
3hs
post-tratamiento se
sacrificaron las larvas y analizaron

proliferación
en EO
30´
3 hs post-tratamiento
Para esto se decidió recurrir al uso de BrdU como método de estudio
Antecedentes
Obtención de larvas
Parejas de adultos de
Aclimatación a 25ºC
Inyección de las hembras con hCG
Rhinella arenarum
OMP: Proteína que se localiza en el citosol de las NRO maduras
GAP-43: Proteína que se expresa durante etapas tempranas del desarrollo neuronal.
NCAM: Proteína expresada por NRO inmaduras
GOLF: Proteína acoplada a los receptores de las NRO y se activan al unirse a moléculas odoríferas
Marcadores neuronales:
BrdU
Célula apoptótica
3 hs
No decae la inmunomarca de OMP

No decae la expresión proteica de OMP

No decae expresión de ARNm de Golf
3 hs
No hay aumento de células apoptóticas
GAP-43: Se expresa en células que comienzan un camino de diferenciación neuronal

NCAM: Se expresa en neuronas inmaduras

OMP: Se expresa en neuronas maduras
NO fue posible colocalizar BrdU con marcadores de estadios de diferenciación más avanzados

Ésta técnica debe ser validada en cada modelo biológico en el que se pretende realizar los estudios y bajo las condiciones particulares de experimentación


• El BrdU no es recomendable en estudios de diferenciación neuronal en el EO de .
Aunque puede utilizarse con éxito como marcador de proliferación a tiempos cortos postratamiento
en este modelo.
expresión de OMP y Golf en NRO maduras
estrés oxidativo
Alterando la estructura y fisiología de las CS
Rhinella arenarum
Xenopus laevis
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