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PCR

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by

sofia vivanco

on 8 May 2014

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Transcript of PCR

PCR
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA

CARMEN ROBLES
SOFÍA VIVANCO
El propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.
Escuela de Bioanálisis
Cuarto Semestre
BIOLOGIA MOLECULAR
Historia
Técnica de la biologia molecular diseñada por el Dr. Kary Mullis en 1987.
Utilizo el PCR para amplificación del gen de la hemoglobina humana, y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.
Termociclador
Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.
Diagrama de la extracción del DNA genómico (previamente realizado)
COMPONENTES DE LA PCR
El DNA a partir del cual queremos obtener una copia de un fragmento, es decir, el DNA que queremos amplificar. Este DNA se conoce como
DNA molde.

TAQ-POLIMERASA
ya que es termoestable y elimina la necesidad de añadir nuevas cantidades de polimerasa durante el proceso de termociclado ya que el ADN polimerasa se inactiva a 90. De esta forma es posible utilizar un único tubo cerrado en una máquina de termociclado relativamente simple para realizar todo el proceso.

Iones divalentes: (Mg2+)
, agregado comúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otro catión divalente. Actúa como cofactor de la polimerasa.

Una solución tampón o buffer
 que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.
Adyuvantes de la PCR

Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR.

Se usa DMSO, glicerol o BSA.
El adyuvante más utilizado es el BSA. El BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa
Polimerasa
En un principio, la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria "E. Coli", pero esta es sensitiva a alta temperatura, por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol
Separa la doble hebra de DNA y se convierte en hebra sencilla.
Apareamiento o “anneling”:
El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más
Los cebadores “primers” previamente diseñados, reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases.
Desnaturalización
Polimerización o Extensión
Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”, en el espacio comprendido entre ambos “primers”, y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’. De esta forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesario para ADN polimerasas que requieran activación por calor.
Se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso.
Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario)
Los pasos 1, 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario
En la PCR hay una amplificación exponencial
Bibliografía
http://www.bioversityinternational.org/fileadmin/bioversity/documents/publications/Molecular_Markers_Volume_1_es/III_3_PCR.pdf

GERALD KARP. Biologia Celular y Molecular. Mc Graw Hill. Ed: 5. Mexico. 2009.

file:///C:/Users/user/Downloads/Reacci%C3%B3n%20en%20cadena%20de%20la%20polimerasa.pdf

http://gmo-crl.jrc.ec.europa.eu/capacitybuilding/manuals/Manual%20ES/Sesi%C3%B3n6.pdf

http://www.elementos.buap.mx/num23/pdf/16.pdf

http://highered.mcgraw-hill.com/olc/dl/120078/micro15.swf
Permite la síntesis “in Vitro” de secuencias específicas de ácido
desoxirribonucleico (ADN)
Tipos de PCR
RT
PCR
Anidada
altamente específica
El producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación
in situ
se realiza en preparaciones fijadas sobre un
portaobjeto
puede detectarse cantidades pequeñísimas del material genético
reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación.
Multiplex
se amplifica más de una secuencia en una misma reacción.
se obtiene la información de varios loci en una sola reacción, utilizando menor cantidad de molde para el análisis y menor cantidad de reactivos.
Se utiliza como molde inicial el ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc (ADN complementario)
Tiempo Real
Permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original. Puede dividirse en:
a-
Técnica basada en fluorocromos no específicos.

b-
Técnica basada en sondas específicas.
El ADN se une al fluorocromo produciendo fluorescencia que es medida por un termociclador apto para PCR en tiempo real.
¿Què es la PCR ?
Polymerase Chain Reaction (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa permite generar una gran cantidad de copias de un fragmento de DNA (ácido desoxirribonulceico).
El requisito fundamental para poder llevar a cabo la reacción es disponer de fragmentos cortos de DNA de cadena sencilla complementarios a los extremos del fragmento a amplificar.
FUNDAMENTO
Se fundamenta en la capacidad ADN polimerasa para replicar hebras de ADN. Esta enzima realiza la síntesis de una cadena complementaria de ADN en sentido 5`3`usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena.

Ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas: Separar las hebras de ADN recién formadas entre si tras cada fase de replicación dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.
Iniciadores de la reacción:
Las enzimas DNA polimerasas únicamente son capaces de añadir nucleótidos al extremo 3’ libre de una doble cadena de DNA. Son necesarios por tanto moléculas cortas (entre 10 y 30 bases) de DNA de cadena sencilla.

Nucleótidos libres:
las enzimas DNA polimerasas van a crear una cadena complementaria a la cadena molde mediante la incorporación de nucleótidos al extremo 3’ libre del cebador que se ha unido a la cadena molde. Los nucleótidos se añaden en forma de desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTPs).

Estos cuatro componentes son los elementos básicos que es necesario incorporar a la reacción para que se complete una PCR.
PROCESO
Efecto Peltier
Calentar/enfriar tubos invirtiendo la corriente eléctrica
Métodos para visualizar PCR
ELECTROFORESIS
Para poder analizar el o los fragmentos obtenidos en el PCR se usa la electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida, permite separar estos fragmentos de acuerdo al tamaño de cada uno.
Tanto agarosa como acrilamida forman una especie de red con agujeros de tamaños diferentes, por la cual se obliga a pasar los fragmentos de ADN, “jalándolos” a través de corriente eléctrica, hacia el polo positivo, ya que la carga de una molécula de ADN es negativa por la presencia de grupos fosfato (P-).
Los fragmentos más pequeños pasarán primero a través de la red de agujeros, mientras que los más grandes se irán retrasando y atorando en los hoyos; de esta manera los fragmentos de tamaños similares migrarán a ritmos similares.

Si hay muchos fragmentos de un mismo tamaño se agruparán todos juntos, por lo que podremos verlos formando una banda en el gel.
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