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DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO

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Angel Ramírez Reyes

on 20 April 2015

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CARBONO
Producirá el máximo rendimiento de producto o biomasa por gramo de sustrato usado.
Será barato, de calidad consistente y disponible a lo largo del año.
CRECIMIENTO MICROBIANO
NUTRITIVOS
MEDIOS DE CULTIVO
DISEÑO DE MEDIOS DE CULTIVO
FÍSICOS
REQUERIMIENTOS
Temperatura
pH
80-90%
Sólo neutrofilas
PARASITARIAS
Plamoptisis
Plasmólisis
POTENCIAL REDOX
Eh ambiente (pH=7):
+0.2 a 0.4V
Aeróbias < -0.2V
Anaeróbias >-0.2V
b)Anaerobias estrictas: O2-->H2O2 (tóxico)
e)Anaerobias aerotolerantes: adaptación (Fermentativas)
c)Anaerobias facultativas: ambas condiciones
a)Aerobias estrictas: O2 como único Hidrogenión
d)Microaerofílicas: bajo O2, alto CO2
1/2 del peso en seco
AUTÓTROFAS (LITÓTROFAS): agua, sales minerales y CO2
FOTÓTROFAS: agua, luz y CO2
HETERÓTROFAS (ORGANÓTROFAS): en general sobre organismo superiores o en descomposición.
Glu, Lact, OH´s, COH´s, Ac.org.

CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS

Métodos
TURBIDIMETRIA
NITRÓGENO
14% del peso en seco.
Lo toman de la atmósfera--> NH4+ el cual es utilizado (vía glutamato-glutamina) como fuente de N, por descomposición de proteínas, simbiosis ó apartir de NO3-
Medición Rápida
Reproducible
ADN,ARN, ATP
Proteínas
Vitaminas
Enzimas
P-lípidos
Aminoácidos

FÓSFORO(3%)
AZUFRE(1%)
K, Na,Mg, Ca, Fe, Mn, Zn, Cu, Co, Se, Mo.
OTROS
Cultivos relativamente densos
No distingue células vivas o muertas
No con células que tiendan a formar aglomerados

PESO SECO
Determinación:
Separar las células del medio
Desecar (105°C, 24 h)
Enfriar
Pesar
Desventaja
componentes volátiles de la célula pueden perderse
existir alguna degradación.
recobrar humedad durante el pesado
ACTIVIDAD METABÓLICA
Formación de productos metabólicos:
gases, ácidos;
Tasa de utilización de sustrato:
oxígeno o la glucosa.
Cámara de Petroff-Hausser
Cámarade Neubauer
Oligoelementos-->co-factores

RECUENTO EN PLACA
Vertido en placa
Extensión en laca
NÚMERO MAS PROBABLE
Células viables
Microorganismos difíciles de cultivar en medio solido
Tabla estadística

FILTRACIÓN
FACTORES DE
CRECIMIENTO
Esenciales
Del ambiente
Sintetizadas
Mayoria: coenzimas
Vitaminas
Aminoácidos
Purinas
Pirimidinas

RADIOACTIVIDAD
Radiófilos:
Deinococcus radiodurans
TOXICIDAD
Toxitolerantes:
Pseudomonas putida
Tolera concentraciones mayores al 90% de tolueno además lo usa como fuente de carbono
Presión
Barófilos: Crecen mas rápido a p > 1atm
Barófilas obligadas: Sólo crecen en p > 1atm

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FES ZARAGOZA QFB
LAB. MICROBIOLOGÍA FARMACÉUTICA

EQ.5
PRESÍON OSMÓTICA
EN EL FONDO DEL OCEANO p=1500atm
O
RECUENTO DIRECTO
N
M
P
¿Qué es un medio de Cultivo?
Son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos.

Su fabricación, preparación, conservación y uso,
asegura
la
exactitud
,
confiabilidad
y
reproducibilidad
de los resultados obtenidos.
clasificación
de acuerdo a su composición química
Medio Sintético
Medio Complejo
Se preparan a partir de compuestos puros en proporciones definidas
sintéticos
Complejo
Se preparan a partir de ingredientes de origen natural cuya composición química no está del todo definida.
Permitirá el mayor índice de producto formado.
Causará la menor cantidad de problemas en la aeración, agitación, extracción, purificación.
Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989
FORMULACIÓN DEL MEDIO
ELEMENTOS NECESARIOS
PARA BALANCEAR LA ECUACIÓN ELEMENTAL
C, H, O, N, S, P, Mg, K
Elementos traza: Fe, Zn, Cu, Mn, Co, Mo, B
Oxigeno
Factores de crecimiento
AGUA
Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989
DATOS NECESARIOS PARA FORMULAR UN MEDIO DE CULTIVO
Coeficiente de rendimiento del sustrato
Composición química del microorganismo que vamos a utilizar
COMPONENTES ELEMENTALES EN
BACTERIAS, LEVADURAS Y HONGOS
Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989
La energía para el crecimiento de microorganismos proviene de la oxidación de componentes del medio o de la luz.
FUENTES DE ENERGÍA
fuentes de carbono
Los carbohidratos se utilizan comúnmente como fuentes de carbono en procesos de fermentación microbiótica.
El carbohidrato mas disponible es el almidón obtenido desde los granos de maíz.
Los granos de cebada pueden ser germinados y calentados para proveer la malta.
Factores que influyen en la elección de fuentes de Nitrógeno
Se prefiere amoniaco o ión amonio
Influencia en el patrón de fermentación
Sales
Minerales
Mayoritarios
Minoritarios
mg/L
Sodio
Magnesio
Potasio
Azufre
Calcio
Fosforo
mcg/L
Cobalto Cobre
Hierro Manganeso Molibdeno Zinc
control para la nitrato reductasa
REQUERIMIENTOS DE OXIGENO
Los medios pueden influir en la disposición de oxígeno.

Metabolismo rápido
ReologÍa
Antiespumantes

Reología
Los componentes individuales de el medio pueden influir en la viscosidad final del medio y su comportamiento posterior con respecto a la aeración y agitación.

Agente antiespumante
Son agentes tensoactivos que reducen la tensión superficial de las espumas hasta dispersarlas.
Algunos agentes utilizados son:
ácidos grasos, ésteres, siliconas y algunos alcoholes.
Obtención
factores que influyen en la elección de fuente de carbono.
Influye directamente en el precio de venta del producto.

Legislación del gobierno.
En la Unión Europea se impulsa el uso de azúcar de remolacha...los precios de importación se vigilan para la competición nacional.

Esterilización.
Puede afectar la capacidad del CHO para fermentar, es mejor esterilizar por separado el azúcar
Reacciona con iones amonio o aminoácidos y forma un compuesto de nitrógeno negro que inhibe el crecimiento de los microorganismos.
Formación de sub-productos
mayor producción (alta concentración de azucares)
baja productividad
(metabolitos secundarios)
sol.
Utilizando azúcares que no se metabolizan tan fácil como la lactosa.
Usando procesos de alimentación semi-continuo o continuo de glucosa o sacarosa.



Las proteínas en el medio, se desnaturalizan con el aire y se forma una capa que no se puede romper tan fácilmente.
La espuma causas muerte célular (autolisis)
y la posterior liberación de proteínas de estas,lo que aumentará la estabilidad de la espuma.
PROPIEDADES DEL ANTIESPUMANTE
C
Suero de Leche.
Licor de maíz.
Subproductos
Objetivo:
Comparar diferentes fuentes de nitrógeno necesarias para el crecimiento microbiano utilizando métodos analíticos para evaluar dicho crecimiento.
METODOLOGÍA
Tomar asada de Candida utilis

Inocular matraz con medio semilla
Incubar con agitación de 200 r.p.m a 28°C por 24 hrs.
Inocular con 1 mL de cultivo con medio semilla
Preparar 100 mL de medio de producción para cada fuente de nitrógeno
Incubar con agitación de 200 r.p.m y 28°C durante 96 hrs.
Agitar el matraz
Tomar muestra de 10 mL con pipetas esteriles a las 0, 24, 48, 72, 96 hrs de incubación
Colocar en tubos con tapa de rosca y guardarlas en congelación
propagación
“DETERMINACIÓN DE
DENSIDAD OPTICA Y PESO SECO”
Tomar 5 mL de cultivo de cada muestra
Colocar en tubo de ensayo
Centrifugar 5 min a 3000 r.p.m
Separar sobrenadante y guardar para DNS
Agregar 5 mL de solución salina para resuspender
Determinar densidad óptica a 540 nm con blanco de agua destilada

Transferir la suspensión a tubo de ensayo (peso cte.)

Centrifugar mismas condiciones
Desechar sobrenadante
Llevar paquete celular a peso cte. a 70°C
DETERMINACIÓN DE PESO HÚMEDO”
Tomar 1 mL de cultivo de cada muestra
Colocar en tubo de ensayo ya pesado
Centrifugar 5 min a 3000 r.p.m
Retirar sobrenadante
Pesar tubo con sedimento
Registrar peso de masa celular
“DETERMINACIÓN DE AZÚCARES REDUCTORES POR EL MÉTODO DNS”
Preparar la DNS
Colocar en tubo de ensayo 1 mL de sobrenadante
Agregar 1 mL de DNS y homogeneizar
Llevar mezcla a baño de agua a ebullición durante 5 min.
Inmediatamente poner en agua fría
Agregar 8 mL de agua destilada
Determinar densidad óptica a 575 nm con agua destilada como blanco
Realizar lo mismo para cada solución de la curva de glucosa
Reactivo de DNS. Acido 3,5-dinitrosalicílico (C7H4N2O7; PM 228,1) al 0,1 % (p/v), tartrato sódico potásico [NaK(COO)2(CHOH)2*4H2O; PM 282,23] al 30 % (p/v) en NaOH (PM 40) 0,4 M. Disolver 1 g de ácido 3,5-dinitrosalicílico y 300 g de tartrato sódico potásico en 200 ml de hidróxido sódico 2 M (16 g de NaOH en 200 ml de agua destilada) y diluir hasta 1000 ml con agua destilada. El reactivo debe guardarse en bote oscuro (color topacio), siendo estable durante varias semanas.
Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.
bibliografía.
1. Britton M. Industrial Microbiology. U.S.A: McGraw-Hill, 1976.
2. A. Jobson, F. D. Cook and D. W. S. Westlake. Microbial Utilization of Crude Oil Department of Microbiology.[consulta: 20 de febrero de 2009] University of Alberta, Edmonton, Alberta, Canada
3.Principles of Fermentation Technology. P.F. Stanbury and A. Whitaker. Pergamon Press, 1989
4.Marroquín S.A. Principios de Microbiología Industrial. México: Química, 1961: 311-319.
5. Bradford MM (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254.
CLASIFICACIÓN NUTRICIONAL DE LOS ORGANISMOS
Leuconostoc mesenteroides
E. coli
S.typhimurium

Gleobacter violaceus
Alicia Hernández, Alfaro I. y Arrieta R. Microbiología Industrial, Costa Rica: EUNED, 2003, pp. 21-24

Determinación de azucares reductores por DNS

N
Se basa en una reacción redox que ocurre entre el DNS y los azúcares reductores presentes en la muestra

Su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico

Su principal ventaja radica en su alta sensibilidad y productividad debido a que es un método espectrofotométrico
Fuentes
Tortora, Gerard J. Introducción a la microbiología, 9ª ed. Buenos Aires: Medica Panamericana, 207.

Romero Cabello. Microbiología y Parasitología Humana. Editorial Panamericana, 3º Ed. 2007

Bello D, Carrera Bocourt E, Díaz Maqueira Y. Determinación de azúcares reductores totales en jugos mezclados de caña de azúcar utilizando el método del ácido 3,5 dinitrosalicílico ICIDCA. Sobre los Derivados de la Caña de Azúcar, vol. XL, núm. 2, mayo-agosto, 2006, pp. 45-50,
Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar Cuba

Romero Cabello. Microbiología y Parasitología Humana. Editorial Panamericana, 3º Ed. 2007

Tortora, Gerard J. Introducción a la microbiología, 9ª ed. Buenos Aires: Medica Panamericana, 207.

Tortora, Gerard J. Introducción a la microbiología, 9ª ed. Buenos Aires: Medica Panamericana, 207.

Tortora, Gerard J. Introducción a la microbiología, 9ª ed. Buenos Aires: Medica Panamericana, 207.

Tortora, Gerard J. Introducción a la microbiología, 9ª ed. Buenos Aires: Medica Panamericana, 207.

Tortora, Gerard J. Introducción a la microbiología, 9ª ed. Buenos Aires: Medica Panamericana, 207.

Castillo R. Francisco. Biotecnología ambiental. Editorial Tévar. 2005.
Romero Cabello. Microbiología y Parasitología Humana. Editorial Panamericana, 3º Ed. 2007

Britton M. Industrial Microbiology. U.S.A: McGraw-Hill, 1976.
muerte humano 10 Gy
500Gy
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