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漢方薬誘導した薬物相互作用の評価

11月16日文献ゼミ
by

智揚 全

on 15 November 2012

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Transcript of 漢方薬誘導した薬物相互作用の評価

漢方薬誘導した薬物相互作用の評価 有機アニオントランスポーター1に注目する 11月16日文献ゼミ 四年生 全 智揚 背 景 漢方薬は世界中幅広く使用されている 西洋薬との相互作用する可能性も注意しなければならない OAT1 有機アニオントランスポーター Organic Anion Transporter 1 腎臓 に局在し 薬物排泄 スペクトル NSAIDS類 降圧薬 抗てんかん薬 利尿薬 抗生物質 抗ウイルス薬 目的 漢方薬のOAT1を介する輸送の調節を評価する in vitro 漢方薬をスクリーン in vivo ラットで再確認する 漢方薬 OAT1 OAT1の機能的調節 mRNAの発現的調整 + 実験1 hOAT1の機能の分析 目的 OAT1機能の確認 次の実験に必要なデーターを収集 1日目 2日目 3日目 細胞を播種 培地を交換 MDCK IIとhOAT1を安定的に発現するMDCK/hOAT1を用いた 基質は[3H]-PAHを用いた。プロべネシドも併用してみた 取り込み実験 氷冷HBSSで止める 取り込み1時間 プレ培養15分 分析方法: 1N NaOHで細胞を溶け ブラッドフォード法によりタンパクを定量 液体シンチレーションカウンターで線量を測定 (hOAT1の阻害剤) [3H]-PAHの取り込み結果 MDCK II MDCK/hOAT1 MDCK/hOAT1+
プロべネシド 結論 hOAT1の機能は確認した 漢方薬による取り込み阻害実験の時間は1 minとした [3H]-PAHの取り込み速度は1 min内で線型 ゆえに 実験2 漢方薬のin vitroスクリーニング 目的 漢方薬30種類・生薬33種類から
hOAT1の機能を影響するものを探し出す 方法 1日目 2日目 3日目 細胞を播種 培地を交換 MDCK IIとhOAT1を安定的に発現するMDCK/hOAT1を用いた 基質は[3H]-PAHを用いた。漢方薬・生薬も併用してみた 取り込み実験 氷冷HBSSで止める 取り込み1分間 プレ培養15分 分析方法: 1N NaOHで細胞を溶け ブラッドフォード法によりタンパクを定量 液体シンチレーションカウンターで線量を測定 方法 コントロールとの差を考察 桂枝茯苓丸 六味地黄丸 加味逍遥散 龍胆瀉肝湯 辛夷清肺湯 杞菊地黄丸 知柏地黄丸 黄芩 黄連 実験3 MDCK IIとMDCK/hOAT1細胞に対して漢方薬の毒性 目的 2種類の細胞に対して漢方薬の毒性の研究 1日目 2日目 3日目 細胞を播種 培地を交換 MDCK IIとhOAT1を安定的に発現するMDCK/hOAT1を用いた 37℃ HBSS洗浄×2 (5,50,500 g/mL) 各濃度漢方薬エキス添加 分析方法: 方法 5日目 48時間培養 37℃ HBSS洗浄 100 L 0.5 mg/mL MTT試薬添加 100 L DMSOで15分間溶解 100 L 0.5 mg/mL MTT試薬を添加 570 nmの吸光度をELISAリーダーで測量 結論 hOAT1に対する阻害効果が強い7種類の漢方薬と2種類の生薬を確認した 漢方薬 桂枝茯苓丸、六味地黄丸、加味逍遥散、龍胆瀉肝湯、辛夷清肺湯、杞菊地黄丸、知柏地黄丸 生薬 黄芩、黄連 黄芩、黄連とプロべネシド併用の場合 1日目 8日目 15日目 350 g-400 g(8-10週齢)のオスWistarラットを用いた 15日目から実験: ペントバルビツール(50 mg/kg)の腹腔内投与で麻酔 PE-50カテーテルをラットの太もも部の静脈と動脈に挿管 発熱の毛布で体温を維持 方法 自由に飼育 薬物強制飼養 結論 シスプラチンとコントロール群と比べて、有意なCLPAH、CLInとCLsecPAHの低下は示した。 CLsecPAHの低下によって、桂枝茯苓丸投与群、加味逍遥散投与群のCLPAHは有意に低下した。 桂枝茯苓丸の大量投与群で、CLPAHとCLsecPAHの濃度依存的に低下は観察された。 漢方薬の使用量の増加によって、糸球体ろ過作用より、尿細管分泌能力は調節された。 実験4 動物実験 目的 in vitroで探し出した7種類の漢方薬と2種類の生薬のOAT1に対する作用をin vivoで再確認 実験5 漢方薬によるrOAT1 mRNA転写の調整 目的 漢方薬によるrOAT1 mRNAの転写量の影響を調べる 方法 上記実験のラットから左腎臓を摘出し rOAT1 mRNAを定量した 特定のプライマーでrOAT1 mRNAとGAPDHを同時に増幅し その中、RNAを抽出した 結論 シスプラチン投与群のrOAT1 mRNAの転写量は有意に低下 桂枝茯苓丸投与群と桂枝茯苓丸の大量投与群には、有意差つけるだけでなく、濃度依存性も示した 総括 桂枝茯苓丸と加味逍遥散はOAT1を介する輸送の阻害とOAT1発現の調節によって、腎臓における能動分泌を減少した 研究の手順は他の薬物トランスポーターに対する漢方薬の調節の評価に有用 研究の結果は薬物安全性情報として有益 漢方薬エキス pH=1.2 胃 小腸 pH=1.2 pH=6.8 5分間超音波処理 pH=6.8 5分間超音波処理 ろ過 動脈カテーテル 静脈カテーテル 静脈: 方法 PAH/inulin(30 mg/kg)in生理食塩水を注射 その後、持続的にPAH/inulin(12 mg/mL)in 生理食塩水を静脈内(1 mL/100g体重)投与 定常状態に到達 動脈: 投与前、投与後30 min、45 minと60 minの時に、血液サンプルを採取 サンプルの分析: 遠心し、血清をLC-MS/MSで分析 パラメーターの求め クリアランス(CLx)は下記の式で計算 CLx=Ix×Iy/PL Ix=薬物(PAHとinulin)の濃度 Iy=注射の速度 PL=血清の中の薬物の濃度 PAH分泌のネット量は下記の式で計算 CLsecPAH=CLPAH×CLIn
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