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Norma Brasileira ABNT NBR 15350/2012 Ecotoxicologia aquáti

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on 12 November 2013

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Transcript of Norma Brasileira ABNT NBR 15350/2012 Ecotoxicologia aquáti

Os ouriços do mar não apresentam dimorfismo sexual externo, sendo a sexagem feita pela coloração dos gametas:

Machos: coloração branca
Fêmeas: coloração alaranjada





Os organismos selecionados para obtenção dos gametas devem ser lavados previamente com água de diluição para remoção de fezes e outros detritos da superfície corpórea.

Calcular a média dos valores obtidos nas três subamostras, multiplicar por 100 (fator de diluição), obtendo-se assim o número de ovos por mL da solução.

Calcular o volume dessa solução que contenha o número de ovos necessário para cada ensaio.

O volume calculado deve ser acrescentado aos recipientes-teste e não pode exceder 1% do volume da solução-teste. Se isto ocorrer, concentrar a solução de ovos por meio de sedimentação dos ovos e remoção de parte do sobrenadante.

A transferência dos ovos para as soluções-teste deve ocorrer:


no prazo máximo de 30 min após a confirmação de 80 % de fecundação para L. variegatus
após 2 h a partir da fecundação para E. lucunter

Reunir os lotes viáveis em um recipiente.
Após a sedimentação dos óvulos, descartar o
sobrenadante e filtrar através de malha
de aproximadamente 350 µm.
Acrescentar água de diluição, elevando-se o volume para 600 mL e aguardar novamente a sedimentação dos óvulos. Repetir três vezes esse processo de lavagem.



A coleta e manuseio dos gametas deve ocorrer em local com temperatura ambiente entre 10 °C e 30 °C.

Recomenda-se a utilização de gametas de três machos e três fêmeas para cada ensaio.


Lytechinus variegatus (Echinodermata Echinoidea) (Lamarck, 1816)

pertencente a família Toxopneustidae
carapaça esverdeada e achatada inferiormente
espinhos de cor variando desde verde até púrpura arroxeada.
alimenta-se de macroalgas, vive em locais onde estas são abundantes
possui o hábito de recobrir-se com detritos vegetais, pequenas conchas, etc.
podem ser encontrados desde a zona entre marés até cerca de 20 m de profundidade.
comum na região do Caribe e na costa atlântica da América do Sul, ocorrendo desde a Califórnia do Norte (EUA) até a costa sudeste do Brasil.




Verificar o estágio de desenvolvimento dos 100 primeiros organismos de uma das réplicas adicionais do controle.

Encerrar o ensaio quando 80 % de organismos no controle estiverem em estágio de larva pluteus bem desenvolvido (braços de comprimento no mínimo igual ao comprimento do corpo da larva) com 0,5 mL de formol tamponado


24 h a 28 h para L. variegatus
36 h a 42 h para E. lucunter

Observar em intervalos de uma em uma hora

Medir a salinidade, o pH e o oxigênio dissolvido das e registrar os dados na ficha de controle do ensaio

Sedimento-controle: sedimento usado para avaliar a aceitabilidade do ensaio, quando conduzido com amostras de sedimento.


Sedimento-referência: sedimento coletado na região de estudo que causa o menor efeito deletério aos organismos.


Substância de referência: substância química utilizada para avaliação da sensibilidade dos organismos-teste


Toxicidade crônica: efeito deletério causado pela amostra no desenvolvimento embriolarval do organismo–teste no período de exposição do ensaio


Valor crônico: média geométrica dos valores de CENO e CEO, nominais ou reais.

CENO
(maior concentração de efeito não-observado)
maior concentração da amostra que causa efeito deletério no desenvolvimento embriolarval dos organismos, estatisticamente significativo em relação ao controle, nas condições do ensaio.


CEO
(menor concentração de efeito observado)
menor concentração da amostra que causa efeito deletério no desenvolvimento embriolarval dos organismos, estatisticamente significativo em relação ao controle, nas condições do ensaio.


CIp
(Concentração de inibição)
concentração da amostra que causa redução de uma determinada porcentagem no desenvolvimento embriolarval dos organismos em relação ao controle (p=12 %, 25 %, 50 % ou outra porcentagem) nas condições do ensaio.

Expor os espermatozoides (50 bilhões espermatozóides/mL) em tubos de 10 mL contendo a solução-teste ou água de diluição por 40 min a 1 hora.

Adicionar 2.000 óvulos aos tubos-teste contendo espermatozoides.

Aguardar 20 min para fertilização.

Encerrar o teste com 500 µL de formaldeído tamponado.

Leitura:
- microscópio ótico.
- câmara de Sedgwick-Rafter.
- registrar o número de óvulos fertilizados dentre
os 100 primeiros óvulos observados.

Procedimento

A água do mar reconstituída pode ser preparada a partir de sais comerciais ou de reagentes diluídos em água processada

Salinidade: 30-37 unidades
pH: 7,8 a 8,4
(ajustada com soluções de HCl ou NaOH)

Aeração: agitação ou aeração mínima de 24 h, para solubilização total dos sais e estabilização do pH

Antes de utilizar a água, registrar os valores de oxigênio dissolvido, pH e salinidade

Anexo B
Preparo de água do mar reconstituída

Acrescentar 1 mL a 2 mL de solução de esperma ao recipiente contendo 600 mL de solução de óvulos.

Aguardar aproximadamente 5 min, após leve agitação, para obtenção da solução de ovos.

Efetuar o cálculo da porcentagem de fecundação: homogeneizar e coletar 1 mL da solução de ovos e diluir para o volume final de 100 mL com água de diluição. Agitar bem e retirar uma subamostra de 1 mL para contagem em câmara de Sedgwick-Rafter.

Proceder à contagem do número de ovos, identificáveis pela membrana de fecundação à sua volta.

Deve haver um mínimo de 80 % de fecundação. Caso isso não ocorra, acrescentar maior quantidade de solução de esperma e realizar nova contagem depois de transcorridos 5 min.

No total, esse procedimento de contagem deve ser realizado no máximo três vezes.

Caso a fecundação não atinja 80 %, o lote de gametas deve ser descartado.

Fecundação

O esperma, identificado por sua cor branca, deve ser coletado com pipeta Pasteur de ponta fina, diretamente dos gonóporos.


Não pode entrar em contato com água até o início dos experimentos.


O esperma deve ser colocado em um pequeno recipiente e mantido em caixa térmica com gelo.

No momento da fecundação, preparar uma solução de esperma, na proporção de 0,5 mL de esperma para 25mL de água de diluição, misturando-se bem para dissolução de grumos.

A solução de esperma deve ser preparada após o término da lavagem dos óvulos e usada imediatamente no processo de fecundação

Coleta de espermatozoides - Machos

As fêmeas devem ser apoiadas com a superfície aboral voltada para baixo em um recipiente menor que seu diâmetro, de modo que os gonóporos fiquem imersos na água de diluição.


Os óvulos devem ser coletados por um período máximo de 15 min, para evitar que sejam utilizados os imaturos, liberados com a desova prolongada.

Com pipeta pasteur, retirar uma subamostra de ovócitos de cada fêmea e observar sua viabilidade ao microscópio.
- arredondados, lisos e de tamanho homogêneo.

Óvulos com tamanho ou formato irregular ou com micrópila expandida indicam óvulos envelhecidos e portanto inviáveis, devem ser descartados.

Coleta de ovócitos - Fêmeas

Injeção de 2,5 mL de KCl 0,5 M na região perioral do ouriço em dois pontos diametralmente opostos.

Para que o KCl espalhe na cavidade celômica, deve-se agitar o ouriço suavemente.

Os gametas são liberados através dos gonóporos, localizados na superfície aboral do ouriço.

Esse procedimento promove a liberação de todos os gametas (maturos e imaturos), de tal forma que o organismo não pode ser reutilizado em curto espaço de tempo.

Por Injeção de KCl 0,5 M

Obtenção de gametas

Os organismos adultos coletados devem ser transportados em caixa térmica, sem água, para o laboratório, onde devem ser transferidos para tanques de manutenção com água reconstituída ou água do mar natural e aeração forte.


Recomenda-se a coleta de macroalgas do loca de origem dos ouriços para acomodação destes na caixa térmica, para manutenção da umidades e alimentação dos organismos no laboratório


Recomenda-se o retorno ao mar do lote de organismos, após a obtenção dos gametas


Antes da introdução de cada ouriço no tanque de manutenção, observar se ocorreu liberação de gametas durante o transporte. Caso tenha ocorrido, este organismo não pode ser utilizado e deve ser mantido em tanque separado dos demais.

Coleta dos organismos e manutenção no laboratório

ANEXO A
Coleta e preparo de gametas para obtenção do organismo-teste

Echinometra lucunter (Echinodermata Echinoidea) (Linnaeus, 1758)

pertencente a família Echinometridae
espinhos grossos bastante resistentes e coloração negra.
encontrado comumente sobre tocas escavadas em rochas em regiões de mar calmo ou batido.
alimenta-se de macroalgas e animais incrustantes.
ocorre desde a Flórida (EUA) até o sul do Brasil, bem como em regiões costeira,
como Antilhas, Bermudas, Ascenção, Santa Helena e Angola.

Deve possuir:

a) referencia do método e da espécie utilizados;
b) todos os dados necessários para identificar a amostra;
c) data e hora de coleta da amostra, data do início e do término do ensaio;
d) dados biológicos (quantificação do efeito nas soluções-teste), físicos
químicos referentes ao ensaio;
e) resultado do ensaio com intervalo de confiança em nível de 95% para amostras onde é efetuado o cálculo expresso em CENO, CEO, VC ou CIp ou expresso de forma qualitativa (tóxico ou não-tóxico);
f) método estatístico utilizado;
g) modificações introduzidas e eventuais ocorrências durante a realização do ensaio.

Relatório

Para cada réplica, determinar o número total de organismos normais e anormais.

Para detectar diferenças significativas em relação ao controle, o número médio de organismos normais em cada solução-teste é comparado com o número médio obtido no controle.

Recomenda-se o uso de método estatístico que permita avaliar os efeitos da amostra no desenvolvimento embriolarval dos organismos, como teste de hipóteses e interpolação linear.


Algumas análises estatísticas são recomendadas e descritas em USEPA (2002).


A CENO, a CEO e a CIp são expressas em porcentagem para efluentes líquidos e em mg/L para substância química. O valor crônico é calculado através dos valores obtidos de CENO e CEO.

Análise qualitativa:

Tóxico: há diferença estatisticamente significante no desenvolvimento dos organismos em relação ao controle.

Não-tóxico: não há diferença estatisticamente significante no desenvolvimento dos organismos em relação ao controle.

Análise dos dados

Diluições

Tubos-teste
5 concentrações da substância-teste
+
1 controle (água de diluição)


4 tubos para cada (4 réplicas).
Réplicas adicionais do controle para avaliação do momento adequado do encerramento do ensaio.


Os organismos-teste devem ser transferidos para os recipientes-teste. Deve-se tomar o cuidado para liberar os ovos próximos da superfície da solução-teste.



O ensaio deve ser realizado com no mínimo quatro réplicas para cada solução-teste e mantido em temperatura de:

23-27 °C para L. variegatus
24-28 °C para E. lucunter

Fotoperíodo: 12 h -16 h de luminosidade
Oxigênio dissolvido: > 4,0 mg/L

Recomenda-se que as amostras sejam moderadamente aeradas até atingir o valor adequado de oxigênio dissolvido.


Para determinação qualitativa não é necessária diluição.

Ensaio definitivo

O recipiente contendo as amostras coletadas deve ser totalmente preenchido para minimizar a presença de ar.

Armazenamento da amostra

no máximo 12 h ao abrigo de luz, resfriada.
no máximo 48 h em temperatura < 10 °C, sem congelamento.
No máximo 60 dias em temperatura < - 10 ° C (congelamento).

Efluentes e água do mar ou estuarina

O preparo e a preservação das amostras devem seguir o descrito na ABNT NBR 15469.


A manipulação das amostras deve ser efetuada em local com temperatura ambiente entre 10 °C e 30 °C


Cuidados devem ser tomados com relação ao congelamento de amostras líquidas e com o tempo de armazenamento de amostras sólidas, uma vez que as características originais podem ser modificadas.

Preparo e preservação das amostras

Princípio:

Este método consiste na exposição de ovos de ouriço-do-mar à amostra ou a várias diluições de amostra durante o período de desenvolvimento embriolaval:

24 h a 28 h para L. variegatus.
36 h a 42 h para E. lucunter.

O resultado é determinado pela comparação do percentual de larvas normais obtido nas amostras em relação ao controle

Método de ensaio

A sensibilidade do lote de organismos-teste deve ser avaliada por meio de um ensaio com uma substância de referência:

sulfato de zinco heptahidratado ou
dodecil sulfato de sódio


Caso o resultado do ensaio com a substância de referência esteja além dos limites da carta-controle, realizar um novo ensaio de sensibilidade em paralelo com a amostra, utilizando um novo lote de organismos.

Ensaio de Sensibilidade

Ovos de ouriços-do-mar L. variegatus ou Echinometra lucunter fecundados in vitro,
obtidos de organismos adultos, conforme descrito no Anexo A

Organismo-teste

Requisitos

Água de diluição: água utilizada para preparar as soluções-­estoque, soluções-­teste e o controle


Água natural: água coletada em campo sem ajustes de pH e/ou de sais.

Água reconstituída: água processada com adição de sais ou água natural ajustada, para as condições exigidas para o organismo-teste.

Água da interface sedimento e água: água localizada imediatamente acima do sedimento.


Água intersticial: água que ocupa os espaços entre as partículas sólidas do sedimento


Elutriato: solução aquosa obtida após adição de água de diluição a uma amostra sólida submetida à agitação e posterior decantação ou, quando necessário, centrifugação ou filtração.


Controle: conjunto de organismos-teste expostos à água de diluição nas mesmas condições dos ensaios, utilizado para avaliar a aceitabilidade do ensaio.

Termos e definições





Esta norma especifica um método de ensaio para avaliação da toxicidade crônica de curta duração de amostras de água marinha, estuarina, intersticial de sedimento, interface sedimento e água, efluentes líquidos, elutriato, substâncias químicas solúveis ou dispersas em água sobre o desenvolvimento embriolarval de Lytechinus variegatus e Echinometra lucunter

Objetivo

Toxicidade Aguda

United States Environmental Protection Agency (USEPA).
Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and receiving waters to marine and estuarine organisms

Ensaio de Fertilização com ouriço-do-mar Lytechinus variegatus





Estímulo elétrico obtido com um circuito de corrente alternada e transformador de 35 V

Aplicar até 5 pulsos elétricos, de aproximadamente 10 s, com intervalo de 10 a 15 s, na superfície aboral, próximo aos gonóporos.

Com o início da liberação dos gametas o estímulo elétrico deve ser interrompido.

A não liberação dos gametas pode indicar que eles não estão maturos.

Este método viabiliza a utilização do mesmo organismo em vários ensaios e, após a sexagem, os ouriços podem ser mantidos em tanques separados.

Por Estímulo Elétrico

Expressão dos resultados

Os resultados são considerados válidos se, no término do período de ensaio, a
porcentagem de pluteus bem desenvolvidos no controle for superior ou igual a 80 %











O resultado pode ser expresso em CENO, CEO, VC, CIp (nominais ou reais) ,tóxico ou não tóxico


Validação dos resultados


Analisar em câmara de Sedgwick-Rafter o estágio de desenvolvimento e a ocorrência de anomalias nos 100 primeiros organismos de cada réplica.

Primeiramente deve ser analisado o controle, pois este deve ser utilizado como referência para leitura das soluções-teste, que deve ser aleatória.










Deve-se somar, em cada solução-teste, o total de organismos afetados.

Os óvulos eventualmente encontrados na amostra não podem ser considerados pois não foram fecundados.

Leitura do ensaio

Lavagem do material

Detergente neutro
Água de torneira
Acetona
Água de torneira
Solução de ácido nítrico ou ácido clorídrico 10%
Água de torneira
Água processada (Destilada/deionizada)

A limpeza inadequada dos materiais utilizados no ensaio ecotoxicológico pode influenciar no resultado do ensaio.

A água de diluição (água do mar natural ou reconstituída) é utilizada para:

diluição de amostras
manuseio de gametas
manutenção dos organismos adultos
controle do ensaio

Condições físico-químicas da água de diluição:
pH: 7,8 - 8,4
Salinidade: 30 – 37 unidades

A água do mar natural, quando utilizada, deve ser filtrada através de um sistema de filtração com porosidade máxima de 1 mm e aerada antes do uso.

Água de diluição

Norma Brasileira
ABNT NBR 15350/2012

Ecotoxicologia aquática
Toxicidade crônica de curta duração
Método de ensaio com ouriço-do-mar (Echinodermata: Echinoidea)

Condições para realização do ensaio

Associação Brasileira de Normas Técnicas (ABNT). Ecotoxicologia aquática – Toxicidade crônica de curta duração - Método de ensaio com ouriço-do-mar (Echinodermata:Echinoidea). ABNT-NBR no. 15350, 2012.

United States Environmental Protection Agency (USEPA). Short-term methods for estimating the chronic toxicity of effluents and recliving waters to marine and estuarine organisms. Cincinati (EUA); 1991, 579 p. Registro n.º EPA/600/4-91/003.




Referências

Encerramento do Ensaio
3) Após os 40 min, adicionar 2.000 óvulos aos tubos-teste contendo espermatozoides.

4) Aguardar 20 min para fertilização.

5) Encerrar o teste com 500 µL de formaldeído tamponado.

6) Leitura:
- microscópio ótico.
- câmara de Sedgwick-Rafter.
- registrar o número de óvulos fertilizados dentre os 100 primeiros óvulos observados.



Choque elétrico (35 V)
Choque osmótico (KCl)

Verificar a viabilidade dos óvulos: redondos, lisos e de tamanho regular.

PROCEDIMENTO

1) Coleta de gametas

Metodologia


Determinar a toxicidade aguda e crônica do Sulfato de Zinco em ouriços-do-mar Lytechinus variegatus.




Ensaio de Fertilização para
Ensaio de Desenvolvimento Embriolarval para Toxicidade Crônica


Objetivos

Resumo dos Requisitos

Príncipio
Avaliar a capacidade de fertilização de espermatozoides expostos
ânus
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