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Copy of Qualificação Débora Venske

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Débora Rieger Venske

on 11 April 2014

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Transcript of Copy of Qualificação Débora Venske

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOQUÍMICA


LECTINAS COMO BIOMOLÉCULAS MODULADORAS DA NEUROPLASTICIDADE


Aluna: Débora Kurrle Rieger Venske
Orientador: Dr. Rodrigo Bainy Leal


Florianópolis, agosto de 2012

Objetivos:
O objetivo geral desse trabalho é estudar os mecanismos celulares e moleculares associados à ação neuroprotetora e moduladora da neurotransmissão produzidos pela lectina extraída das sementes de Canavalia braziliensis (ConBr). Nesse sentido, será focalizada a modulação pela ConBr de vias de sinalização intracelular, associadas à produção de fatores neurotróficos, bem como a potencial modulação de receptores glutamatérgicos e monoaminérgicos e de transportadores de glutamato. Além disso, como um estudo adicional pretende-se investigar a atividade biológica de ConBr em linhagens celulares tumorais do SNC e comparar essa ação com culturas primárias (astrócitos e neurônios).
Objetivo Geral:
Objetivos Específicos:
RESULTADOS:
ConBr, a lectin from Canavalia brasiliensis seeds, activates neuroprotective pathways and increases a CREB-mediated expression of BDNF.
CAPÍTULO 1:
ConBr induz morte celular de células de glioblastoma de ratos (C6), ativa p38MAPK e inibe ERK e AKT.
CAPÍTULO 3:
Introdução:
GLICOBIOLOGIA:
Participantes das interações celulares.
Glicanos no Sistema Nervoso Central:
Materiais e métodos:
Resultados:
ConBr stimulates Akt phosphorylation at the early time points after i.c.v. injection.
ConBr stimulates ERK1 phosphorylation at the early time points after i.c.v. administration.
ConBr did not alter JNK1/2/3 phosphorylation.
ConBr did not alter p38MAPK phosphorylation
ConBr stimulates CREB phosphorylation in the hippocampus
ConBr stimulates TrkB expression
ConBr stimulates BDNF expression (mRNA)
ConBr increments the BDNF (protein) content at the late times after i.c.v. administration.
Akt phosphorylation was increased in the late times after i.c.v. injection of ConBr.
ConBr did not change ERK 1/2 phosphorylation at the late times after i.c.v. injection.
DISCUSSÃO:
Discussão:
Em conjunto nossos dados sugerem que a ativação inicial por ConBr das proteínas cinases AKT, ERK1 e PKA induz a fosforilação do fator de transcrição CREB-Ser133, resultando em um aumento, CREB-dependente, da expressão de BDNF. Notavelmente, a fosforilação de AKT também foi aumentada 24h após a administração de ConBr, suportando a noção de que o incremento de BDNF, ConBr-dependente, pode gerar um segundo pico de atividade de AKT via ativação do receptor TrkB.
Conclusão:
CAPÍTULO 2:

Captação de glutamato (24h após i.c.v.);

Atividade da enzima glutamina sintetase (24h após i.c.v.);

Western blot para os trasnportadores GLAST e GLT-1 (18 e 24h após i.c.v.).
Materiais e Métodos:
GLICANOS:
Encontrados ligados covalentemente a proteínas ou lipídeos, formando glicoproteínas e glicolipídeos;
Papel essencial em muitos processos fisiológicos.
Adesão célula-célula,
crescimento celular (Kariya and Gu, 2011),
fertilização (Dell et al., 1999),
infecção por parasitas (Fauquenoy et al., 2011),
interação de receptores e seus ligantes, desta forma interferindo na transdução do sinal, e modulação do desenvolvimento de vários sistemas. (Cobb and Kasper, 2005).
Natureza Glicoprotéica:
Receptores para proteínas de matriz extracelular e fatores neurotróficos;
receptores glutamatérgicos;
transportadores de neurotransmissores;
canais iônicos.
As cadeias de açúcares presentes nestas proteínas parecem estar envolvidas em diversas funções nas células neuronais:

migração celular;
crescimento de neuritos e fasciculação;
formação de sinapses e sua estabilização;
modulação da eficácia sináptica e da neuroplasticidade.
LECTINAS:
Lectinas representam um grupo de proteínas de origem não imune que contém pelo menos um domínio não catalítico que reconhece e liga seletivamente, de forma reversível, a açúcares específicos sobre glicoconjugados (Gorelik et al., 2001, Minko, 2004, Dube and Bertozzi, 2005)
As lectinas estão distribuídas em plantas, animais e fungos.
GALECTINA-1:
Afinidade por glicanos contendo galactosídeos;
Largamente estudada pelos seus efeitos no SNC (Di Lella et al., 2011).
LECTINAS EXPRESSAS NO SNC:
Amplamente expressa no SNC, tanto em neurônios, quando nas células gliais (Akazawa et al., 2004, Sakaguchi et al., 2007).
Apresenta atividade neuroprotetora contra a neurotoxicidade produzida por glutamato (Lekishvili et al., 2006).
Indução de diferenciação de astrócitos (Sasaki et al., 2004);
Estímulo na expressão astrocitária do fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) in vitro e em modelo animal de isquemia (Endo, 2005, Qu et al., 2010);
Inibição da astrogliose e proteção dos danos celulares e funcionais pós-isquêmicos (Qu et al., 2011);
Estímulo da proliferação de progenitores neurais (Sakaguchi et al., 2006, Ishibashi et al., 2007, Kajitani et al., 2009, Sakaguchi et al., 2010).
Variedade de atividades biológicas...
LECTINAS VEGETAIS:
Atividades antitumorais, através de segmentação e morte celular programada, incluindo a apoptose e autofagia (Fu et al., 2011);

Atividade estimuladora da produção de óxido nítrico (NO) (Andrade et al., 1999);

Ação anti-inflamatória através da inibição da produção de citocinas pró-inflamatórias e migração de leucócitos (Cavada et al., 2001);

Atividade. antinociceptiva via modulação do sistema opióide (de Freitas Pires et al., 2011).
Neuroplasticidade (Lin and Levitan, 1991, Scherer and Udin, 1994);

Isolamento e estudo das glicoproteínas sinápticas (Partin et al., 1993, Fay and Bowie, 2006);

Liberação de neurotransmissores (Boehm and Huck, 1998);
Canavalia ensiformis (ConA) no SNC:
Canavalia ensiformis (ConA)
afinidade por glicose/manose
Investigação das propriedades funcionais e bioquímicas de receptores glutamatérgicos ionotrópicos AMPA (Hoffman et al., 1998, Thalhammer et al., 2002), Kainato (Yue et al., 1995, Partin et al., 1996, Everts et al., 1999, Fay and Bowie, 2006) e NMDA (Yue et al., 1995, Everts et al., 1997).
LECTINAS VEGETAIS:
Canavalia brasiliensis (ConBr):
Feijão Bravo do Ceará
Canavalia brasiliensis
Proteína tetramérica - 4 subunidades
Efeitos biológicos em tecidos periféricos:
ConBr
Alta similaridade estrutural a ConA (99%) além da ter a mesma especificidade por glicose/manose (Grangeiro et al., 1997)
Estimulação da produção de óxido nítrico por macrófagos (Andrade et al., 1999);

Apoptose em linfócitos (Barbosa et al., 2001);

Estimulação da liberação de histamina em mastócitos (Lopes et al., 2005);

Atividade central analgésica, quando administrada via oral em camundongos, sendo este efeito aparentemente relacionado a sua ação sobre receptores opióides no SNC (de Freitas Pires et al., 2011).
(Sanz-Aparicio, J. et al. 1997)
Efeitos no SNC:
ConBr
ConBr
ConBr
ConBr injetada i.c.v. também exerce um efeito modulatório (inibitório) da via NMDA/NO/GMPc/PKG e dessa forma também produzindo efeito antidepressivo “like”.
ConBr:
I.Caracterizar, no hipocampo de camundongos, as vias de sinalização envolvidas no efeito neuroprotetor antidepressivo de ConBr, como PKA, CAMKII, MAPK (ERK1/2, p38MAPK e JNK1/2/3), PI3K/Akt, verificando a atividade de fatores de transcrição e expressão de neurotrofinas (BDNF);

II.Considerando o efeito neuroprotetor de ConBr frente a neurotoxicidade glutamatérgica (Russi et al., 2012, Jacques et al., 2012), pretendemos avaliar o efeito da ConBr sobre o metabolismo do glutamato e expressão dos transportadores de glutamato (GLAST e GLT-1), captação de glutamato, atividade de glutamina sintetase no hipocampo de camundongos;

III.Determinar a capacidade de ConBr modular os níveis de Ca2+ intracelular através da modulação de receptores NMDA, canais de Ca2+ dependentes de voltagem ou outros alvos em neurônios em cultura através do uso de técnicas de fluorescência e pach-clamp;

IV.Avaliar, através de estudos in vitro com cultura de células de glioblastoma de ratos (C6) e neuroblastoma humano (SH-SY5Y), a capacidade de ConBr modular processos de morte celular bem como caracterizar o envolvimento das vias PI3K/Akt, ERK1/2, p38MAPK, JNK1/2 3 e caspase 3. Comparar os efeitos de ConBr sobre células tumorais com células em cultura primária (astrócitos e neurônios), para evidenciar possível seletividade na modulação das vias de sinalização e nos processos de morte celular;

V. Será também objetivo deste trabalho determinar as ações de ConBr sobre vias de sinalização intracelular (PKA, CaMKII, ERK1/2, JNK1/2, p38MAPK, PI3K/AKT), fatores de transcrição e expressão de neurotrofinas no modelo de cultura hipocampal organotípica;
ConBr
O SNC é um tecido muito rico em sistemas de transdução de sinal.
Sinalização Celular:
Os diversos módulos de sinalização participam da fisiopatologia de doenças neurodegenerativas e do humor bem como nas respostas terapêuticas frente aos fármacos (Schlessinger, 2000, Kleene and Schachner, 2004, Cohen and Greenberg, 2008, Ghazarian et al., 2010).
Receptores acoplados a proteínas G:
A seguir vamos abordar alguns módulos de sinalização importantes na modulação da plasticidade do SNC e que representam alvos nas estratégias de neuroproteção e na ação de drogas antidepressivas.
MAPKs:
PI3K /AKT:
Cálcio:
CREB - BDNF:
BDNF - TKRB:
Considerando os seguintes aspectos:

1) a importância das cadeias de açúcares presente na superfície da membrana para comunicação intercelular;
2) a natureza glicoproteica da grande maioria dos receptores, canais iônicos e transportadores de neurotransmissores;
3) dados prévios de nosso grupo e da literatura, que demonstram que as lectinas podem modular a neurotransmissão e apresentam um potencial neuroprotetor (Baraúna et al., 2006; Han et al., 2010, Qu et al., 2010; Russi et al., 2012);

Propomos investigar os mecanismos celulares e moleculares pelo qual ConBr pode exercer ação neuroprotetora e modulatória da plasticidade sináptica.
ConBr stimulates PKA activity at the early time points after i.c.v. injection.
ConBr did not stimulate CaMKII phosphorylation.
Aumento da captação de glutamato 24 h após a injeção i.c.v. de ConBr.
RESULTADOS:
Atividade da enzima Glutamina sintetase não foi alterada por ConBr
RESULTADOS:
*** P<0.001
ConBr administrada in vivo estimula a captação de glutamato e modula a expressão dos transportadores de glutamato (GLAST e GLT-1) no hipocampo de camundongos.
* P<0.05
RESULTADOS:
ConBr estimula o aumento dos níveis do transportador de Glutamato EAAT-1, 18 e 24h após tratamento
ConBr não altera os níveis do transportador de Glutamato EAAT-2 18 e 24h após tratamento
RESULTADOS:
•24h após injeção i.c.v. de ConBr (10µg/sítio) foi observado um aumento significativo (P<0.001) na captação de glutamato, sem alteração na atividade da enzima glutamina sintetase;

•ConBr estimula o aumento dos níveis do transportador de glutamato EAAT-1 18 e 24h após tratamento, sem alterar os níveis do transportador EAAT-2.
CONCLUSÕES PARCIAIS:

Estruturas de glicanos são modificadas com o início do câncer.


Padrões de glicosilação alterados: marca registrada do fenótipo de tumores.


Cada tipo de tecido maligno é caracterizado por um conjunto distinto de alterações na expressão de glicanos (Mody et al., 1995, Gorelik et al., 2001, Ghazarian et al., 2010).
INTRODUÇÃO:
MATERIAIS E MÉTODOS:
Efeito de ConBr sobre a viabilidade celular avaliada por MTT.
RESULTADOS:
*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001
Efeito de ConBr sobre a viabilidade celular avaliada por LDH.
RESULTADOS:
*P<0.05
Identificação e quantificação de células necróticas e apoptóticas tratadas com ConBr
RESULTADOS:
***P<0.001
ConBr diminui a fosforilação de ERK1 em cultura de glioblastoma (C6).
RESULTADOS:
*P<0.05
ConBr aumenta a fosforilação de p38MAPK em cultura de glioblastoma (C6).
RESULTADOS:
*P<0.05; **P<0.01
ConBr diminui a fosforilação de AKT em cultura de glioblastoma (C6).
RESULTADOS:
*P<0.05
•Tratamento das células C6 com ConBr induzindo uma intensa morte celular de maneira concentração dependente, sendo este efeito bastante significativo na dose mais elevada de 100µg/ml (P<0.001);

•Através de medidas iniciais por citometria de fluxo sugerem uma morte por apoptose.

•ConBr, na concentração de 100µg/ml, ativa p38MAPK e inibe ERK (6h de tratamento) e inibe AKT (24h de tratamento);


Nossos dados iniciais corroboram com dados da literatura onde lectinas com afinidade por manose/glucose, tem gerado uma crescente atenção por sua atividade anti-proliferativa e antitumoral em relação a vários tipos de células cancerosas.
CONCLUSÕES PARCIAIS:
**P<0.01
*P<0.05; **P<0.01
*P<0.05; **P<0.01
*P<0.05
*P<0.05
*P<0.05; ***P<0.001
*P<0.05; **P<0.01
Camundongos Swiss,
45-50 PN.
ConBr 10ug/sitio i.c.v.
CULTURA CELULAR: Foram usadas células de glioma C6 em passagem 37-39.
MATERIAIS E MÉTODOS:
TRATAMENTO: Células foram incubadas durante 1, 6, 12 e 24h com diferentes concentrações de ConBr (0,1 a 100μg/ml).
VIABILIDADE CELULAR:
MTT;
LDH;
WESTERN BLOT:
ERK 1/2;
AKT;
p38MAPK;
Citometria de Fluxo:
Em conclusão, os resultados apresentados indicam a capacidade de ConBr, administrada in vivo, em ativar importantes vias de sinalização envolvidas na neuroplasticidade e neuroproteção, além de estimular a captura de glutamato. Estes dados reforçam achados prévios, que indicam ConBr como uma molécula multifuncional capaz de induzir plasticidade sináptica e neuroproteção. Por outro lado, os novos estudos indicam uma ação citotóxica de ConBr sobre células tumorais (glioma C6) induzindo morte celular.
CONCLUSÃO:
I.Determinar a capacidade de ConBr modular os níveis de Ca2+ intracelular através da modulação de receptores NMDA, canais de Ca2+ dependentes de voltagem ou outros alvos em neurônios em cultura através do uso de técnicas de fluorescência e pach-clamp;

II.Investigar, através da técnica de western blot, as vias de sinalização PI3K/Akt, ERK1/2, p38MAPK e JNK1/2/3, caspase 3 em cultura de células de glioma de rato (C6) e neuroblastoma humano (SHSY5Y) e em culturas primárias de astrócitos e neurônios;

III. Avaliar parâmetros de viabilidade celular (MTT e LDH) e citometria de fluxo em cultura de células neuroblastoma humano (SH-SY5Y);

IV.Avaliar a seletividade das células cancerosas a ConBr utilizando os mesmos parâmetros de morte celular usados nas culturas de C6 e SHSY5Y em modelos de cultura de células primárias de astrócitos e neurônios, comparando os resultados;

V.Realização do doutorado sanduíche na UAM (Madrid) estudando os efeitos de ConBr em modelos in vitro de culturas organotípicas e de isquemia, determinando as ações neuroprotetoras de ConBr e a modulação de ERK1/2, JNK1/2, p38MAPK, PI3K/AKT bem como seus alvos. Avaliação da modulação dos níveis de Ca2+ intracelular por ConBr em culturas neuronais, linhagens e culturas organotípicas. Caracterização da modulação de receptores glutamatérgicos ionotrópicos.

VI.Elaboração e submissão de artigos científicos;

VII.Elaboração e apresentação da tese.
PLANO DE ATIVIDADES:
CRONOGRAMA:
OBS: A coluna em cinza se refere ao período destinado à realização de doutorado-sanduíche no exterior, vinculado ao CNPq. O estágio será realizado no laboratório da professora MANUELA GARCÍA LÓPEZ, no Departamento Farmacologia de la Faculdad de Medicina de la Universidad Autónoma de Madrid (UAM).
OBRIGADO!
Concanavalina A (ConA):
atividade anti-proliferativa e antitumoral em melanoma humano (A375), carcinoma hepático (HepG2). (Liu et al., 2009).


ConA e ConBr
linhagem celular humana de leucemia (MOLT-4 e HL-60), inibem seletivamente a proliferação de células tumorais, (Faheina-Martins et al., 2012).
"Mire veja: o mais importante e bonito, do mundo, é isto:que as pessoas não estão sempre iguais, ainda não foram terminadas [...]"
Grande Sertão Veredas,
de Guimarães Rosa
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