Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Copy of Presentacion Validacion Bactec

No description
by

Aldo Rosas

on 25 June 2013

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Copy of Presentacion Validacion Bactec

“Validación precolaborativa del sistema BD Bactec™ 9000
como método alternativo automatizado para determinar
esterilidad en suero parenteral y leche ultrapasteurizada”

TESIS PROFESIONAL
PARA OBTENER EL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
 
P R E S E N T A
Nadia Eliette Rosas García
Sandra Berenice Gómez Gutiérrez
 
Director: Dra. Ma. Refugio Torres Vitela
Asesor: M. en C. María de los Ángeles Olea Rodríguez
Universidad de Guadalajara
Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Microbiología Sanitaria Investigación del Centro Universitario de Ciencias Exactas e Ingenierías de la Universidad de Guadalajara bajo la dirección de la Dra. Ma. Refugio Torres Vitela y la asesoría de la M. en C. María de los Ángeles Olea Rodríguez.
El proyecto fue patrocinado por la empresa Becton Dickinson de México y recibió apoyo del Programa de Becas para la Educación Superior Convocatoria 2012
Lastres García, et al., 2001
Las industrias están sometidas a las reglas del mercado.
El consumidor es especialmente sensible a los productos, por lo que los fabricantes cuidan mucho de la calidad de éstos.

Cualquier deficiencia puede originar problemas sanitarios, en ocasiones graves para la salud del consumidor y provocar la inmediata retirada del producto o incluso el cierre del fabricante por parte de las autoridades sanitarias
INTRODUCCIÓN
Avis Forsythe & Hayes, 2002
“Aseguramiento de la calidad”.
Evaluación de las materias primas
Estándares del producto final.

En las industrias es importante aplicar todos los medios posibles para asegurar la calidad del producto terminado.
Cada componente y cada paso del proceso de elaboración deben someterse a un escrutinio intenso para garantizar la calidad del producto terminado.
La validación es la confirmación y provisión de evidencia objetiva de que se cumplen los requisitos para un uso o aplicación prevista.

En la industria el contar con procesos validados equivale:
Productos
de calidad
Efectivos para
su uso propuesto
Ahorrar
Menores errores
de ejecución
Tiempo
Dinero
Posicionarse
en el mercado
La validación de un método alternativo permite demostrar que los resultados obtenidos por éste, son comparables a los resultados obtenidos utilizando el método de referencia
NMX-CC-9000-IMNC-2001; Feldsine, et al., 2002
Validación
Método
Alternativo
Método de
Referencia
Indicadores de desempeño del método
Interlaboratorio
Siguiendo el mismo proceso
Intralaboratorio
Demostrar su aplicabilidad
Taza de falsos negativos
Taza de falsos positivos
Estudio
Colaborativo
Estudio Precolaborativo
Especificidad
Sensibilidad
Feldsine, et al., 2002
La AOAC establece dos fases para la aprobación de un método alternativo:
ANTECEDENTES
Día a día se recure a nuevas tecnologías y recursos con el fin de desarrollar sistemas rigurosos de calidad que aseguren obtener un producto en conformidad con las especificaciones.
BD Bactec
9000

TM
Becton Dickinson, 2012
BD Bactec™ 9000 es un sistema utilizado y validado para la realización de hemocultivos automatizados.

Se basa en la detección, mediante una tecnología fluorescente no invasiva, del CO2 producto del metabolismo de los microorganismos que pudiesen estar presentes y se desarrollen en los viales.
Rohner & Auckenthaler, 1999
Este sistema consta de:

Viales que, además de medio de cultivo, contienen un sensor fluorescente sensible al CO2.




Instrumento de incubación, monitorización y agitación continua provisto de fotodetectores que miden automáticamente cada 10 min el nivel de fluorescencia, equivalente al volumen de CO2 interpretando la medición según parámetros de positividad preprogramados.
USP, 2007; Lacasa Godina, 2003
Según la definición más estricta de esterilidad, una muestra se considera estéril solamente cuando en ella hay ausencia total de microorganismos viables.

La esterilidad Comercial por su parte se establece como la probabilidad de encontrar esporas vivas capases de desarrollarse en el producto, enfocándose principalmente en la estabilidad del producto. Por lo que los riesgos a la no esterilidad solamente se refieren al aspecto comercial y no aspectos de salud
Esterilidad
Macías, et al., 2000
Los sueros parenterales son preparaciones destinadas a la inyección a través de la piel u otro tejido externo, en lugar de la vía alimenticia, administrando las sustancias activas que contienen directamente en un vaso sanguíneo, órgano, tejido o lesión, usando la fuerza de gravedad u otra fuerza.

La terapia intravenosa conlleva un riesgo significativo de complicaciones infecciosas locales o sistémicas. Se acepta que existe un riesgo mínimo cuando existe un apego a las normas de asepsia.
Sueros Parenterales
USP, 2007
Antes de 1980, la mayoría de las epidemias de bacteriemias asociadas con soluciones contaminadas se derivaron de contaminación intrínseca, las buenas prácticas de fabricación la han reducido a un problema poco común.

Todos los lotes de suero parenteral en sus envases finales deben de probarse en cuanto a su esterilidad.
Medina Mota, et al., 2007

Miembros del género Klebsiellae presentan un crecimiento rápido de 10 UFC/mL e incluso concentraciones que sobrepasan 10 UFC/mL en un periodo de 24 horas y son incapaces de enturbiar de manera perceptible las soluciones.
Suero parenteral
Destrucción de los microorganismos viables de importancia en salud y deterioradores del producto
Codex Alimentarius, 2012 ; NOM-184-SSA1-2002., 2002; Lacasa Godina, 2003
 El Codex Alimentarius define a la leche como la secreción mamaria normal de animales lecheros obtenida mediante uno o más ordeños sin ningún tipo de adición o extracción, destinada al consumo en forma de leche líquida o elaboración ulterior.

En leche cruda existe extensa contaminación bacteriana, por lo que se realizan tratamientos térmicos para su eliminación total como lo es la ultrapasteurización.
135°-149°C por 2 a 8 segundos
Leche ultrapasteurizada
La característica esencial es tener esterilidad comercial, conservando la mayor parte de las propiedades de la leche pasteurizada.

Sabor, color, contenido de vitaminas, distribución de las materias nitrogenadas y equilibrios salinos.
En Inglaterra, se encontró Bacillus sporothermodurans en la leche ultrapasteurizada.
Microorganismo no deseado y productor de HRS, que pueden sobrevivir a una temperatura de esterilización.

En Francia, Alemania y Bélgica se permite que en las leches ultrapasteurizadas tengan un recuento de 10 UFC/mL
Leche Ultrapasteurizada
MICROBIOLOGÍA
Obteniendo una alternativa para el análisis especifico de muestras de suero parenteral y leche ultrapasteurizada.
Este trabajo pretende evaluar la efectividad de un sistema automatizado que permitiese ahorro de tiempo y reducción de posibles errores en la ejecución de pruebas de esterilidad.
JUSTIFICACION


El sistema BD Bactec™ 9000 permite detectar contaminación microbiana de interés para la industria en leche ultrapasteurizada y suero parenteral.
HIPÓTESIS
Objetivo general
 
Realizar la validación precolaborativa del sistema Bactec™ 9000 como método alternativo automatizado para el procesamiento de pruebas de esterilidad en suero parenteral y leche ultrapasteurizada.
OBJETIVOS
Objetivos específicos

Comparar el sistema BD BactecTM 9000 contra el MGA 0381 de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos en el análisis de muestras de suero parenteral.

Comparar el sistema BD BactecTM 9000 contra el método establecido en el Apéndice Normativo B de la NORMA Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995 en el análisis de leche ultrapasteurizada.

Detectar la sensibilidad y especificidad del sistema BD BactecTM 9000 mediante niveles de inóculo alto y bajo siendo este último menor a 10 UFC/10mL.
1
3
4


Establecer la taza de falsos positivos y falsos negativos del sistema BD BactecTM 9000.

Establecer tiempo mínimo de detección de
E. coli O157:H7 93111 en el sistema BD BactecTM 9000
para solución Hartamann y leche ultrapasteurizada.
5
2
Comparación de Positividad de Muestras de solución Hartmann problema entre el método tradicional y el sistema BD BactecTM 9000
Comparación de Positividad de Muestras de leche ultrapasteurizadaproblema entre el método tradicional y el sistema BD BactecTM 9000
Comparación de los niveles fluorescencia en muestras negativas y positivas por el sistema BD BactecTM 9000
Comparación de los niveles fluorescencia en muestras negativas y presuntas negativas por el sistema BD BactecTM 9000
Las proporciones positivas para el método alternativo y los métodos de referencia no son estadísticamente diferentes (P<0.05)
Valor crítico:
X2=3.84
Análisis McNemars para el BD BactecTM 9000 en leche ultrapasteurizada
RESULTADOS
Primera Etapa
Bactec VS Tradicional
RESULTADOS
Segunda Etapa
Bactec VS Cepa Referencia
Concentración de E. coli O157:H7 93111 inoculada en la botella de medio BD Aerobic Plus/F para solución salina fisiológica.
Estandarización
Las proporciones positivas para el método alternativo y los métodos de referencia no son estadísticamente diferentes (P<0.05)
Comparación del Nivel 4 en solución salina fisiológica entre ambos métodos de análisis para la segunda etapa del estudio
Concentración de E. coli O157:H7 93111 inoculada en la botella de medio BD Aerobic Plus/F para solución Hartmann
Las proporciones positivas para el método alternativo y los métodos de referencia no son estadísticamente diferentes (P<0.05)
Comparación del Nivel 4 en solución Hartmann entre ambos métodos de análisis para la segunda etapa del estudio
Concentraciones de E. coli O157:H7 93111 en solución Hartamann por tiempos de detección de positivos en sistema BD BactecTM 9000
Suero Parenteral
Curva de Crecimiento de E. coli O157:H7 93111 en solución Hartamann
Dispersión de tiempos de detección de positivos en solución Hartmann por el sistema BD BactecTM 9000
Leche Ultrapasteurizada
Concentración de E. coli O157:H7 93111 inoculada en la botella de medio BD Aerobic Plus/F para leche ultrapasteurizada.
Las proporciones positivas para el método alternativo y los métodos de referencia no son estadísticamente diferentes (P<0.05)
Valor crítico:
X2=3.84
Comparación en Leche Ultrapasteurizada entre ambos de análisis para la segunda etapa del estudio
Concentraciones de E. coli O157:H7 93111 en leche ultrapasteurizada por tiempos de detección de positivos en el sistema BD BactecTM 9000.
Curva de Crecimiento de E. coli O157:H7 93111 en leche ultrapasteurizada
Dispersión de tiempos de detección de positivos en leche ultrapasteurizada por el sistema BD BactecTM 9000
Se confirma la validación precolaborativa del sistema BD BactecTM 900 como método alternativo automatizado en el procesamiento de pruebas de esterilidad en suero parenteral y leche ultrapasteurizada.

No existe diferencia en la comparación entre el sistema BD BactecTM 9000 y el MGA 0381 de la Farmacopea de los Estados Unidos Mexicanos en el análisis de muestras de suero parenteral.

No existe diferencia significativa con (P<0.05) entre el sstema BD BactecTM 9000 y el método establecido en el Apéndice Normativo B de la NORMA Oficial Mexicana NOM-130-SSA1-1995 en el análisis de leche ultrapasteurizada.
CONCLUSIONES
El sistema BD BactecTM 9000 muestra, con concentraciones de 3 UFC/10mL, una sensibilidad de 90% en muestras de suero parenteral y 95 % en muestras de leche ultrapasteurizada, así como una especificidad de 100% para ambas matrices muestréales.

La tasa de falsos negativos es menor de 10% en suero parenteral y leche ultrapasteurizada, en tanto que la tasa de falsos positivos es de 0% en ambas matrices muestréales con concentraciones de 3 UFC/10mL.
El tiempo de detección de E. coli O157:H7 93111 por el sistema BD BactecTM 9000 fue entre de 6 a 14 h en solución Hartmann y entre 5 a 12 h para leche ultrapasteurizada. Mientras que por el método tradicional es de más de 24 h.

El sistema BD BactecTM 9000 representa una herramienta valiosa para ser empleada de manera confiable en la evaluación de esterilidad de suero parenteral y leche ultrapasteurizada, con ventajas significativas en reducción de tiempos que nos permite obtener un resultado rápido y oportuno para la toma de decisiones.
CONCLUSIONES
Validar el método para suero parenteral implementando:
Atmósfera para microorganismos anaerobios.
Temperatura para mohos (20 ºC)

Validar el método para leche ultrapasteurizada implementando:
Atmósfera para microorganismos anaerobios.
Temperatura para microorganismos temofílicos (55 ºC)
Determinar tiempos de detección con una cepa resistente a la ultrapasteurizada:
Bacillus sporothermodurans
Prospectivas
Analítico, descriptivo, experimental y comparativo.
Modelo

experimental
Para fines prácticos, la metodología de este trabajo se dividió en dos etapas, siguiendo las recomendaciones de la AOAC.
Una primera etapa enfocada al análisis de muestras de suero parenteral y leche ultrapasteurizada que se compararon contra los métodos de referencia.
MGA 0381 de la FEUM
Apéndice Normativo B de la NOM-130-SSA1-1995

Una segunda etapa enfocada al proceso de validación del método mediante inoculación intencional de una cepa de referencia en ambas matrices maestrales.
E. coli O157:H7 93111
METODOLOGÍA
Estudios preliminares:
Saneamiento de la superficie externa de los envases de las muestras.
Lavado con agua y jabón
Yodo a 200 ppm
Alcohol 70%

Monitoreo ambiental de flujo laminar
Placas Petri expuestas con AN y ASTEL
Hisopos de muestreo BD Sterile Pack Swab
Primera Etapa
Controles ambientales durante el procesamiento de las muestras:
Placas Petri expuestas
Método General de Análisis 0381 FEUM para muestras de suero parenteral
Método NOM-130-SSA1-1995 para muestras de leche ultrapasteurizada.
Toma de muestra:
BD VacutainerTM
Método BD BactecTM 9000
Secuencia de pasos seguidos en el proceso de la primer etapa
Primera

Etapa

Segunda

Etapa

Estudios preliminares:
Prueba piloto con Solución Salina Fisiológica (SSF).
Estandarización del inóculo
Lavado de células
Preliminares
Obtención de células lavadas de E. coli O157:H7 93111
Procedimiento para curva de crecimiento de E. coli O157:H7 93111
Secuencia de pasos seguidos en el proceso de la segunda etapa
Por cada matriz muéstral: Solución Salina Fisiológica, Suero parenteral y Leche ultrapasteurizada
10 Corridas
2 Muestras y 2 Controles Negativos: 40 en total
4 niveles de inóculo por muestra: 160
3 Repeticiones: 480 muestras inoculadas totales
2 métodos de cuantificación: Vaciado en Placa y NMP 333
Vaciado en placa con medio simple (AN) y medio selectivo (SMAC): 1440 muestras analizadas
4320 análisis en total
Bibliografía
Montaje en fresco
NOM-130-1995
Muestras negativas
Muestras positivas
Pre y post incubación
Muestras positivas
Muestras control
CGPB
Caracteristicas
macroscópicas
Aislamiento de la cepa encontrada en muestras problema de leche ultrapasteurizada.
Colonias puntiformes transparentes en AN.





Colonias circulraes en AIH de mayor tamaño.
Características
microscópicas
Género Bacillus
Bacillus sporothermodurans
Tinción Gram
Tinción de esporas
Movilidad
positiva
Confirmación sertera de espcie solo mediante PCR
Valor crítico:
X2=3.84
Valor crítico:
X2=3.84
Detectar al analito cuando realmente éste se encuentra presente
No detectar al analito cuando éste no se encuentra presente
Detectar al analito cuando éste no se encuentra presente
NO detectar al analito cuando realmente éste se encuentra presente
Bactec VS Tradicional
Bactec VS Cepa Referencia
15 horas
43 horas
26 horas
14 dìas
14 dìas
Análisis estadístico ji-cuadrada McNemar
empleando el programa Excel del paquete de Microsoft
La prueba de esterilidad tiene como finalidad investigar la presencia de microorganismos viables usando medios de cultivo adecuados.
MGA 0381 FEUM
5
6
Full transcript