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La Terapia Genica

Conquiste e prospettive di un nuovo modo di fare medicina
by

Francesca vetrugno

on 16 May 2015

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Transcript of La Terapia Genica

#PreziTemplate @ThePrezenter
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Conquiste e prospettive di un nuovo modo di fare medicina
Il termine
terapia genica
comprende qualsiasi procedura che, attraverso la parziale modifica del corredo genetico cellulare, permetta di curare o alleviare una determinata patologia.

Essa consta di differenti

strategie
e di altrettanto differenti tipologie di
sostanze trasferibili
nelle cellule di un paziente tramite
vettori
, ovvero organismi capaci di veicolare tratti di molecole (nel caso in specie:
geni, segmenti degli stessi, oligonucleotidi, ecc
...) all’interno di altri organismi.

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LA TERAPIA GENICA


EX VIVO

Bersaglio: tessuti le cui cellule siano prelevabili
senza controindicazioni
per il pz (es: cellule ematopoietiche).




IN VIVO

Bersaglio: tessuti le cui cellule
non possono essere prelevate
o
poste in coltura
in vitro (es: cellule cerebrali).


Modalità di inserzione del materiale ereditario
TG Classica
Si forniscono alle cellule bersaglio i geni d'interesse clonati
al fine di ottenerne una corretta espressione. Una volta in ambiente intracellulare, essi eseguiranno una delle seguenti operazioni:

• produrre una
molecola assente
nel pz;

uccidere
direttamente le
cellule malate
(es: producendo una sostanza citotossica);
• attivare le cellule del
sistema immunitario
.


TG Non Convenzionale
Approccio 2:
Approccio 1:
Consiste nell’
inibizione
dell'espressione di geni associati alla patogenesi della malattia o nella
correzione
di un difetto genetico, ripristinando così la normale espressione genica.
Linea germinale
Bersaglio:
Linea somatica
Obiettivo
: inserire cellule transgeniche sia nelle cellule somatiche che in quelle germinali.
TG germinale
Pro
:
Il gene verrebbe trasmesso a
tutta la progenie
o solo ad
alcuni gameti
, a seconda della dimensione del clone delle cellule transgeniche collocato nell’area germinativa.
Potenzialmente, potrebbe essere una cura
definitiva
.
TG somatica
Obiettivo
: correggere il
fenotipo
di una malattia trattando alcune cellule somatiche del malato (come per patologie causate da un'erronea espressione genica che si manifesta prevalentemente a carico di un tessuto).
Pro
:
Data l'impossibilità di rendere un intero corpo transgenico, si procede unicamente con la modifica di una
certa percentuale
di cellule, migliorando i
sintomi
della malattia.
Non
è una cura
definitiva
.
Prelievo
Isolamento delle cellule bersaglio
Collocazione in vitro delle cellule prelevate
Transfezione dei geni tramite vettori e replicazione
Reimpianto/reinfuzione delle cellule transfettate
Transgene inserito per via locale o sistemica
Raggiunge le cellule bersaglio senza prelievo
Classi di malattie curabili:
• disturbi del sistema
immunitario
• malattie infettive
• neoplasie

• malattie ereditarie
Inserzione cromosomale
Inserzione extracromosomale
Vantaggi:
• I geni sono conservati grazie alla replicazione cromosomale;
• Vengono stabilmente espressi a lungo termine se tale modifica avviene nel genoma delle cellule staminali.

Svantaggi:
• L’inserzione avviene quasi in maniera casuale: la sua localizzazione e la risposta all’integrazione genica può variare enormemente da cellula a cellula, determinando:
la non espressione dei geni;
la morte della cellula ospite;
il perturbamento dei normali pattern di espressione di altri geni.
Vettori virali per inserzione cromosomale
All'interno del loro genoma viene ridistribuito il transgene d’interesse, che sostituisce la maggior parte dei geni virali. Il retrovirus ricombinante porterà con sé il transgene nella cellula ospite e lo inoculerà su un cromosoma bersaglio.
Retrovirus inattivati
1.
Il virus inserito potrebbe agire da mutageno d’inserzione e inattivare alcuni geni residenti sconosciuti, causando una mutazione;
2.
I retrovirus attaccano solo le cellule proliferanti, come le cellule del sangue.
Lentivirus
Si tratta di complessi retrovirus, tra cui l'HIV, in grado di infettare cellule non proliferanti (come i macrofagi e i linfociti).
LUIGI NALDINI
Istituto San Raffaele Telethon per la Terapia Genica (TIGET)
Malattia neurodegenerativa da carenza di
Arilsulfatasi
, un enzima coinvolto nel metabolismo di alcune sostante, chiamate sulfatidi, le quali finiscono per accumularsi specialmente nella mielina, danneggiandola.
Leucodistrodia Metacromatica
Immunodeficienza grave, causata da mutazioni a carico del gene
was
che, nelle cellule del sangue, promuove la comunicazione tra citoscheletro e superficie cellulare. I malati vanno incontro a infezioni continue e a disturbi della coagulazione del sangue, oltre ad avere un rischio più elevato di sviluppare leucemie e linfomi.
Sindrome di Wiskott-Aldrich
HIV
Duplice vantaggio
1.
In quanto retrovirus, inserice i suoi geni nei cromosomi dell'ospite;

2.
E' estremamente efficiente nell'infettare le cellule umane, comprese quelle che non si stanno replicando.
Target:
Cellule staminali
emopoietiche (HSC)
prelevate dal MO
Per la leucodistrofia:
veicolo

Per la WAS:
cellule bersaglio da modificare
Procedura:
Amplificazione dell'efficacia del virus attraverso lo smembramento del suo corredo genetico e il suo riassemblamento con i soli geni responsabili della sua abilità di vettore + geni corretti in laboratorio;

Prelievo delle HSC dal MO del pz e trattamento delle stesse con il vettore;

"Conditioning" del pz (2/3 gg prima della reinfusione);

Reintroduzione delle HSC modificate, le quali andranno a colonizzeare il MO.
Prospettive per il futuro
Migliorare gli strumenti a disposizione
focalizzando l'attenzione su:
Gene editing
Controllo della
espressione genica
Vantaggi:
Risolve i problemi derivanti dall'inserzione cromosomale che, in quanto casuale, potrebbe risolversi in apoptosi, inespressione del transgene, perturbamento dei pattern di espressione di altri geni;
Svantaggi:
E' inefficiente nella correzione di cellule in attiva proliferazione (il gene extracromosomale potrebbe non segregare equamente nelle cellule figlie);
La cura di una malattia con un'unica inserzione può non essere risolutiva.
Adenovirus
Normalmente attacca gli epiteli respiratori iniettando nelle cellule il suo genoma, il quale vi persiste come elemento extracromosomale.

Agisce sia su cellule somatiche che germinali, il che rappresenta un grande vantaggio, eppure, proprio perché attacca indiscriminatamente tutte le cellule umane, il rischio è che colpisca anche cellule sane determinando un'infiammazione cronica delle vie respiratorie.
Rischi dell'utilizzo di vettori virali
Reazione immune indesiderata
Targeting della cellula sbagliata
Infezioni
causate dallo stesso virus
Tumori
Alternativa ai vettori virali
Liposomi
Vescicole sferiche composte da un bilayer
lipidico sintetico.
Il DNA da trasferire vi è impacchettato in vitro e, dopo l'inserzione nella cellula, il liposoma è
da essa endociato.
Iniezione diretta
DNA iniettato direttamente nel tessuto bersaglio;
Bombardamento di particelle.
Endocitosi recettore-mediata
Il DNA, accoppiato ad una molecola segnale, si lega a suo specifico recettore di superficie che induce l'endocitosi e il trasferimento genico nella cellula.
Immunodeficienze primarie
(PID)
Vasto ed eterogeneo insieme di rare malattie ereditabili causate da un difetto nei geni implicati nei meccanismi di risposta immunitaria.
SCID
(
Severe Combined Immunodeficencies
): prevedono la contemporanea compromissione di linfociti B, T e NK.
Esse determinano,
nella maggior parte dei casi:
Abnorme suscettibilità alle infezioni;
Aumentata suscettibilità a tumori e
a malattie autoimmuni;
Arresto generale della crescita;
Neutropenia.
Trattamento
Se è presente un donatore HLA-compatibile: trapianto allogenico di HSC;

Se non è presente un donatore HLA-compatibile: trapianto isogenico di HSC modificate in laboratorio.
ADA-SCID
La prima PID ad essere curata con l'ausilio della terapia genica
Deficit dell'enzima
adenosina deaminasi
Deossiadenosina
e
adenosina
non convertite nei loro metaboliti meno tossici (rispettivamente deossinosina e inosina)
Si
accumulano

a livello cellulare
Causano il non regolare sviluppo di
linfociti B
,
T
e
NK
Determinando una
SCID
Terapia
Trapianto allogenico di HSC da donatore HLA-compatibile
Terapia genica
HSR-TIGET
Aiuti, Roncarolo et al. (2009)
Infusione di CD34+ autologhe (prelevate dal MO) trasdotte con vettore gamma-retrovirale contenete il gene ADA in 10 bambini affetti da ADA-SCID
Pz sottoposti a trattamento
nonmieloablativo con busulfan
Nessuna somministrazione di terapia di sostituzione enzimatica dopo l'infusione
Risultati
Tutti i pz sono, ad oggi, vivi;

Le HSC trasdotte hanno attecchito e si sono differenziate nella linea mieloide corretta, contenente ADA, e in quella linfoide;

La (ormai) efficace protezione contro le infezioni e la ripresa dello sviluppo fisico dei bambini hanno reso possibile uno stile di vita normale.
Obiettivi futuri
Perfezionamento della terapia sulla base delle nozioni acquisite dai trial precedenti;

Elaborazione e studio in trial preclinici di nuovi modelli di terapia;

Studio di topi NOD/SCID;

Verifica della sicurezza nell'utilizzo di vettori lentivirali.
Bibliografia
http://embomolmed.embopress.org/content/5/11/1642.short
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK7569/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK21859/
http://biologie.univ-mrs.fr/upload/p230/articlevecteurHIV.pdf
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23845948
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3725417/
http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0805817#t=article
Grazie per l'attenzione!
A cura di: Beatrice Giuliani, Chiara Ossola, Francesca Vetrugno
Vettori virali per inserzione extracromosomale
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