Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Moleküler Biyoloji Teknikleri

No description
by

Esra Dökümcüoğlu

on 26 May 2015

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Moleküler Biyoloji Teknikleri

Moleküler Biyoloji Teknikleri
Hibridizasyon (Filtreleme) Yöntemleri

Biyoteknoloji ve genetik bilimleri günümüzde gıda, tıp, madencilik, çevre gibi pek çok alanda kullanılır ve ihtiyaç duyulur duruma gelmiştir.
Şüphesiz Biyoteknoloji biliminin içinde rekombinant DNA’nın ve gen klonlamasının önemi çok büyüktür.
Bu kadar revaçta ve kullanımda olan gen klonlamasında önemli olan aşamalar, gen taşıyan DNA’nın (veya RNA) saf olarak elde edilmesi, genin yerinin belirlenmesi, genin çıkarılması, Taşıyıcı (vektör) DNA’nın elde edilmesi, gen DNA’sının vektör DNA’sı ile birleştirilmesi, Oluşan rekombinant vektör DNA’nın alıcı hücreye aktarılması, seleksiyon, gen ürününün kontrol edilmesi diye sıralanabilir.

Kaynaklar
www.bilim.org
forum.gıdagündemi.com
Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Zeynep Burçin Çavuşoğlu Yüksek Lisans Tezi
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Patololi Anabilim Dalı Dr.Gaye Güler Tezel , Elektroforez, Western Blot, Southern Blot, Northern Blot
Hücreye Moleküler Yaklaşım Ders Kitabı

WESTERN BLOT TEKNİĞİ

Nükleik asit dizilerinin ve proteinlerin gösterilmesi ve yerlerinin belirlenmesi
HİBRİDİZASYON YÖNTEMLERİNE GİRİŞ


Daha sonraki yıllarda geliştirilen ve RNA2nın tespitinde kullanılan metot, ilkinin ismine gönderme yapılarak Northern Blotlama olarak isimlendirilmiştir (J.Alwine ve G.Stark tarafından 1979’da).
Aynı yaklaşımla en son olarak geliştirilen proteinlerin belirleme metodu Western Blotlama olarak adlandırılmıştır (H.T. Towbin,1979 ve W.N. Burnette, 1981 tarafından).

Blotlama metodu protein ve nükleik asitlerin belirlenmesi amacı ile sıklıkla kullanılan birçok farklı metodun genel ismidir. Ayrıca bu metotlar son yıllarda hibridizasyon veya prob teknolojileri ile paralel olarak kullanılmaktadır. Blotlama elektriksel ortamda jel üzerine göç ettirilen ve fraksiyonlarına ayrılan protein veya nükleik asitlerin bir destek tabakaya aktarıldıktan sonra özgül olarak belirlenmelerini ifade etmektedir.
Bu metotlardan ilk geliştirileni DNA’nın tespitinde kullanılan Southern Blotlama’dır (1975’te). İlk birkaç yıl jel transferi olarak isimlendirilen bu metot, diğerlerinin de bulunması ile birlikte metodu geliştiren E.M. Southern’e atfen Southern blotlama olarak anılmaya başlamıştır.
SOUTHERN BLOT TEKNİĞİ
Southern Blot Hibridizasyon Aşamaları
1) Genomik DNA'nın izolasyonu
2) Spesifik RE ile kesim
3) DNA fragmentlerinin elektroforezi
4) Bantların nütroselüloz membran üzerine transferi
5) Denatürasyon ve fiksasyon
6) Hibridizasyon
7) Otoradyografi ve görüntüleme

İstenilen bir genin veya DNA dizisinin, binlerce baz çiftlik bir DNA molekülündeki varlığının belirlenmesi, moleküler biyoloji ve rekombinant DNA teknolojisi çalışmaları için önemli ve vazgeçilmez işlemlerden biridir.
Özellikle gen yapısı, gen ifadesi, genom organizasyonu, haritalama ve gen aktarımı çalışmalarında (transformantların istenilen geni taşıyıp taşımadığının, kopya sayısının analizi vb) aranılan DNA dizisinin saptanması Southern blotting tekniği ile mümkün olabilmektedir.
Bu teknik ilk kez adını aldığı Southern tarafından 1975 yılında tanımlanmıştır.
Tekniğin temeli, istenilen DNA parçasının ona tamamlayıcı olan radyoaktif veya radyoaktif olmayan birtakım belirleyicilerle işaretlenmiş olan problar kullanılarak hibridizasyonuna ve hibridizasyonun ardından belirleyicinin özelliğine göre radyoaktif, immünolojik, kimyasal yada fluoresan yöntemlerle görünür hale getirilmesine dayanır.
NORTHERN BLOT TEKNİĞİ
Northern blotlama tekniği RNA moleküllerinin analizi için kullanılan bir yöntemdir.
Bu yöntem southern blotlama tekniğine benzemesine rağmen DNA yerine RNA kullanılmaktadır.
Yatay elektroforezde agaroz jelde yürütülen RNA örnekleri uygun problarla işaretlenerek görüntülenmektedir. Northern blotlama yönteminde RNA fragmanları jelde yürütülür, destek
membrana aktarılır ve bu membrandaki özgül RNA dizilimleri belirlenir.
Northern blotlama 4 basamaktan oluşmaktadır. Bunlar; RNA hazırlanması, elektroforez, membrana aktarlması, işaretlenen RNA’ların görüntülenmesi.
RNA örneklerinin hazırlanması ve örneklerin jelde yürütülmesi
Yürütülen jelin görüntülenmesi
Membrana aktarım için transfer sisteminin hazırlanması
Membran sistem üzerine ağırlık konulması ve inkübasyon
Hibridizasyon
RNA işaretlenir
Membran görüntülenmesi
RNA görüntülerinin alınması

Western Blot; dokudaki spesifik bir proteini analiz etmemizi sağlayan moleküler biyoloji tekniğidir. Bu teknik sayesinde dokuda bulunan bir proteinın varlığı, büyüklüğü, konsantrasyonu, konsantrasyon değişimleri, farklı gruplar arasındaki konsantrasyonlarının karşılaştırılması vb. araştırılabilir.
Western Blotta, proteinler öncelikli olarak SDS (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) jelinde büyüklüklerine göre ayrılırlar.
Bu proteinler daha sonra PVDF, nitrocellulose, naylon veya diğer destekleyici yüzeylere transfer edilir ve antikor propları ile bu yüzeyler yıkanır.
Antikorlar ilgilenilen proteinler ile bağlantı kurar. Bu bağlantıyı gözlemlemek için renk üretici olarak kullanılan “chemiluminescence” veya “autoradiography” gibi çeşitli yöntemler kullanılır.

Zaman zaman da bu bağlantının doğal olarak ifade edilmiş protein yoğunluğunu tespit etmek için antikorlar ile ikinci bir bağlantı kuracak enzimlerde kullanılmaktadır. “Western Blotting” sadece proteinlerin tespitleri için değil aynı zamanda onların niceliksel bilgilerini de araştırmacılara sağlarlar.
Analog olarak “Western Blotting” canlı hücre dokularındaki özellikli proteinlerin boyanması içinde kullanılır. Ama yaygın olarak bu işlem için hücre biyolojisinde FISH olarak adlandırılan “immunostaning” teknikleri kullanılmaktadır.
Full transcript