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Untitled Prezi

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by

mary triana

on 5 February 2013

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Transcript of Untitled Prezi

Sensibilidad de LAL = 0.125 EU/mil
Límite de Endotoxina = 2 EU/mil
Curva 0.25 0.125 0.06 0.03 (EU/mil) Control Negativo = -
Standard + + - -
+ + - -
Muestras Prueba Ctrl. + Producto Interpretación
Muestra A (1:16) + + No Pasa
+ + C(-) = -
Muestra B (1:16) - + Pasa
- + C(-) = -
Muestra C (1:16) - - Inválida
- - C(-) = -
Muestra A (1:16) + + Inválida
+ + C(-) = + Prueba de Límite (Pasa/falla) Todas las muestras se deben realizar mínimo por duplicado y se deben hacer paralelamente con:
Control negativo
Muestra (dilucion de trabajo) por duplicado
Control positivo (Con 2 l de endotoxina) 5. ENSAYO DE RUTINA En el método de gelificación la muestra unspike no debe formar gel a menos que este contaminada con endotoxina
El spike debe gelificar, si no lo hace significa que hay inhibición INTERPRETACION Tanto la serie de unspike como de spike se debe hacer por duplicado.
En el ensayo spike la concentración de endotoxina siempre debe ser la misma pero la concentración del producto disminuirá con la serie de diluciones
En el ensayo unspike se hacen diluciones del producto, no se adiciona endotoxina. 4. Validación de producto Proteínas
pueden enlazar endotoxina
proteasas pueden desnaturalizar proteínas de la cascada enzimática
proteínas que cortan coagulógeno e inducen coagulación (e.g. tripsina)
Estrategias
tratamiento por calor
tratamiento con ácido (ácido perclórico [PCA] y ácido nítrico) Causas de realce PRUEBA DE INHIBICION (SPIKE)
pH

La prueba se debe realizar entre pH 6 y 8, si el producto no cumple se usan estrategias
El reactivo LAL tiene una capacidad limitada de tamponación
pH crítico es el de la mezcla de muestra con reactivo

Estrategias
Dilución
Usar Buffer Pyrosol
Ajustar pH de muestra (o dilución de muestra) con NaOH o HCl 4. VALIDACION DEL PRODUCTO
Conocer el producto
4. VALIDACIÓN DEL PRODUCTO

Calcular la MVD
Ensayos preliminares (Spike y Unspike) para caracterizar la interferencia
Determinación de la dilución de trabajo
Validación de la dilución de trabajo (tres lotes) inhibicion y realce Se usa la concentración del producto para convertirla a UE/ml
Si la concentración del producto es 100 mg/ml
Limite = 0.35 UE/mg x 100 mg/ml
= 35 UE/ml Ejemplo (cont.) EJ: producto X: maxima dosis diaria humanos: 1 gramo
Dosis x kg: 1gramo : 0.0143g/kg: 14.3 mg/kg
70 kg

LIMITE ENDOTOX: K : 5 UE/kg : 0.35 UE/ mg
M 14.3 mg/kg Determinación del limite de Endotoxina para un producto K representa el limite de endotoxina
La máxima cantidad de endotoxina que puede ser administrada sin provocar respuesta febril es 5 UE/Kg de peso. Se define como la máxima cantidad de endotoxina tolerable. Cambia dependiendo la vía de administración.
Se ha tomado como peso promedio humano 70 Kg lo que da como dosis total 350 UE PARAMETROS A TENER EN CUENTA Es posible obtener un certificado de análisis del CEE del fabricante del reactivo LAL
Debe ser especifico para una combinación de lotes de LAL y CEE
Los certificados de análisis son aceptados por la FDA , son considerados como un servicio del proveedor pero no exime de la realización del rótulo. CERTIFICADO DE ANALISIS Validación del operario
Validación del rótulo (Sensibilidad del reactivo o Etiqueta)
Validación de Materias Primas: Ej.agua, PA.
Validación del Producto Final
Conocer límite de endotoxina
Conocer el producto: Características (origen, composición), pH
Pruebas preliminares: Unspike / Spike
Prueba inhibicion y realce
Ensayo Final
Prueba de rutina a la Concentración validada VALIDACIONES NECESARIAS Más simple, utilizado con mayor frecuencia (prod. humanos y animales)
El método establecido por la USP y EP
La sensibilidad de la etiqueta del reactivo LAL (l) es la concentración mínima de endotoxina que puede detectar, en la que se forma coágulo
(0,03 – 0,06 – 0,125 – 0,25 EU/ml y 1 EU/ML- dialisados) METODO GEL CLOT El umbral de DO (una DO fija) es utilizado como punto de referencia para la colecta de datos
Mientras más alta la concentración de endotoxina, más corto el tiempo necesario para alcanzar el umbral de DO
punto de referencia para la colecta de datos
Mientras más alta la concentración de endotoxina, más corto el tiempo necesario para alcanzar el umbral de DO
como punto de referencia para la colecta de datos
Mientras más alta la concentración de endotoxina, más corto el tiempo necesario para alcanzar el umbral de DO Método Turbidimétrico/cromogenico Cinético METODOLOGIA LAL 4. Sala de Procesamiento de Lisado 3. Extracción de la sangre Dada por la hemocianina, la proteína transportadora de O2


diferente de la hemoglobina de los
mamíferos porque contiene cobre en vez de hierro. Cuando la hemocianina se oxida, se
vuelve azul. Sangre Azul Colecta de animales
Desangrado
Centrifugación de la sangre
Lavado de las células
Lisado
Retorno de los animales al océano PROCESO MANUFACTURA DE LAL www.pafltda.com . . . . . . . . . . . . . . . . . FABRICACION DE LAL
Stanley W. Watson del “Woods Hole Oceanographic
Institution” empezó a preparar su propio lisado y dar
muestras a las compañías farmacéuticas
El Dr. Watson fundó Associates of Cape Cod, Inc. (ACC) en 1974.
En 1977, la FDA publicó los estándares de
manufactura definitivos para el LAL.
la prueba LAL se establece como prueba de liberación
para dispositivos médicos y se otorga la primera
licencia para la producción de LAL a ACC (1977)
En 1983, la prueba con LAL reemplazo a la Prueba de Pirógenos en casi todas las monografíaías de aguas de la USP
Actualmente, los textos armonizados de las Farmacopeas especifican la prueba LAL para detección de endotoxinas CASCADA DE COAGULACION EN HUMANOS En la presencia de bacterias Gramnegativas O endotoxinas, las células (amebocitos) liberan proteínas al plasma (hemolymph) provocando la coagulación de la sangre del cangrejo.
El cangrejo herradura puede sobrevivir hasta una coagulación masiva de su sistema circulatorio
Se sabe que altos niveles de endotoxina también causan coagulación sanguínea en los mamíferos,sin embargo la coagulación intravascular diseminada causa la muerte. MECANISMO DE DEFENSA PIROGENO: agente productor de fiebre, es decir, sustancias que actuando sobre los centros termorreguladores del hipotálamo producen un aumento de temperatura (fiebre), como los lipopolisacáridos. Puede ser de origen microbiano o no microbiano.
ENDOTOXINA: toxinas “dentro” de una celula
un componente estructural de la pared celular de las bacterias Gram negativas
Es un Inmunomodulador que puede causar:– fiebre, inflamaciones, nausea, vómitos hipertensión, toxicidad en los pulmones, etc. & muerte. DEFINICIONES LAL Lisado de Amebocitos de Limulus








Extracto de las células sanguíneas del cangrejo herradura que forma un coágulo en presencia de endotoxinas. (detecta y cuantifica endotox de bact gram neg) LAL  PRUEBA DE ENDOTOXINAS BACTERIANAS

Associates of Cape Cod, Inc.
PAF

MARY LUZ TRIANA MARQUEZ
BACTERIOLOGA
EJECUTIVA DE VENTAS






O
Entidades reguladoras

INVIMA, Subdirección de Medicamentos
FDA, FARMACOPEAS.
ICA. FDA
INDUSTRIA FARMACEUTICA (MULTINACIONAL Y NACIONAL) EN
COLOMBIA… Estos nuevos capítulos muestran una mejoría sustancial en la claridad y uniformidad de estos documentos.
Estos simplifican el cumplimiento normativo de los fabricantes para productos vendidos en distintos países.
Solo 3 fabricantes autorizados por FDA. Armonización Instrucciones del fabricante del reactivo LAL
“Bacterial Endotoxins Test” (BET), capítulo 85, USP 30
“Guideline on Validation of the Limulus Amebocyte Lysate Test as an End-Product Endotoxin Test for Human and Animal Parenteral Drugs, Biological Products, and Medical Devices,” FDA, 1987 DOCUMENTOS REGULATORIOS La dilución del producto seleccionada para dilución de trabajo, debe ser dos veces mayor que la primera dilución en la cual la interferencia no se detecta

La dilución seleccionada no debe sobrepasar la MDV. Interpretación preliminar Sólo se puede probar que un resultado positivo es falso en la ausencia de endotoxina
Si los resultados indican un incremento repentino sin explicación, se debe buscar primero si se presentó contaminación con endotoxina y luego cambios de formulación o proceso
Falsos Positivos son poco comunes. Ejemplos incluían tripsina = Interferencia
b-glucanos = FDA. Contaminantes de los productos inyectables. Interferencia o contaminante no permitidos…? PRUEBA DE REALCE (UNSPIKE)


Es un incremento en la sensibilidad del ensayo que conduce a que la cantidad de endotoxina presente se sobrestime
Controles positivos de producto en ensayos de gel-clot no indican la presencia de estimulación
Estimulación puede causar que un producto que debió pasar no lo reportemos como negativo 4. VALIDACION DEL PRODUCTO Inhibición (CONTAMINAR)--- SPIKE
Es una disminución en la sensibilidad del ensayo que conduce a que la cantidad de endotoxina presente se subestime
Los controles apropiados permiten detectar la posibilidad de inhibición
Si no hay eliminación de inhibición por el producto, mediante diluciones, se puede llegar a liberación con base en un resultado negativo inválido

Realce ------- UNSPIKE
es un incremento en la sensibilidad del ensayo que conduce a que la cantidad de endotoxina presente se sobrestime PRELIMINARES
(Ensayo Spike y UnSpike) Pruebas preliminares
Determinar reactividad e interferencia
Dilucion de trabajo
Estandarizar la preparación de la muestra
Reconstitución
Ajuste de pH
protocolos de extracción
Filtración, separación etc. CARACTERIZACION DEL PRODUCTO 4. VALIDACION DE PRODUCTO MDV: Límite de endotoxina
sensibilidad LAL (λ)

Máxima dilución de un producto en la que se puede detectar el límite de endotoxina En Farmacopea
Calculado con base en la DL 50 del producto por Dosis máxima permitida por el peso promedio
La cantidad de endotoxina permitida en un producto, depende de la dosis administrada
Consecuentemente, a mayor volumen de producto administrado menor será el limite de endotoxina por unidad de peso o volumen
El limite de endotoxina para productos parenterales de alto volumen es de 0.5 UE/ml 4.VALIDACION DEL PRODUCTO

Conocer el límite de la Endotoxina 5000 UE/vial / 5 ml = 1000 UE/ ml 0.5 ug
+ 5 ml agua lote de endotoxina: # 106
lote de LAL: # 507-11-344
sensibilidad LAL: 0.125 UE/ml
potencia dada o “asumida” en el certificado es 5000 UE/vial 2. VALIDACION DEL ROTULO Confirmación de la Potencia de Endotoxina y sensitividad LAL
Se realiza por Cuadruplicado
Cada vez que se cambia lote de LAL y endotoxina 2. VALIDACION DEL ROTULO Se realiza por cuadruplicado
Una sola vez…BPL 1. VALIDACION DE OPERARIO Baño termostatado a 37°C +-1ºC.
Agitador Vortex, gradilla
Pipetas graduadas de 10, 5 y 1 Ml (puntas de 1ml)
Tubos dilucion y reaccion apirógenos
Micropipetas
Puntas
Papel Parafilm
Reactivo de LAL
Control estándar de Endotoxina
Agua apirogénica Certificada MATERIAL REQUERIDO Preciso control-incubadora una temperatura constante de 37 ° C ± 0,5 ° C
Cuantificar endotoxinas con una sensibilidad de 0,001EU/ml

Diseño de sólido, sin partes móviles y de bajo mantenimiento

Descartables(consumibles) de bajo costo

El Pyros Kinetix ® Flex los tubos lectores fueron diseñados específicamente para las pruebas de endotoxinas. Características PYROS KINETIX Coagulación o Gel-clot (gel con coagulina, formación de coágulo)
Turbidimétrico (agregaciones de coagulina se presenta turbidez)
punto final o cinético
Cromogénico (cromoforo amarillo se mide la densidad óptica)
punto final o cinético METODOS DE LA PRUEBA LAL Los países no tienen una fiscalización adecuada

Los laboratorios no siguen normas internacionales

Los métodos no están validados de acuerdo a
reglas internacionales

Muchos laboratorios realizan la prueba LAL con
total desconocimiento de la técnica poniendo en
peligro la salud publica. PROBLEMAS MAS COMUNES DE MPLEMENTENTACION DE LAL LAL ha demostrado ser más sensitivo que la Prueba de Pirógenos
LAL puede detectar cantidades subpirogénicas de endotoxinas
LAL tiene menos interferencias que Prueba de pirógenos LAL – PRUEBA DE PIROGENOS Ambiental/salud pública (agua de mar y agua dulce)
endotoxinas ambientales y transportadas por el aire

Análisis de agua ultrapura para la industria de semiconductores
Análisis de alimentos

Investigación clínica limitada Medicamentos parenterales
Dispositivos médicos
Productos biológicos
Medios de cultivo para células
Soluciones para hemodiálisis: dialisado, dialisado concentrado, agua producto APLICACIONES DEL LAL 2. Desangrado 1. Captura El cangrejo de herradura de hoy dia es idéntico al de hace 300 millones de años atrás FOSIL VS CANGREJO ACTUAL Las bacterias predominantes en el ambiente oceánico en que vive el cangrejo herradura son las bacterias Gram negativas.
Cualquier lesión del cangrejo herradura expondrá su sangre a estos organismos y a endotoxina.
Los cangrejos herradura no pueden responder a una infección microbiana produciendo anticuerpos.( lo hacen por medio de coagulacion) MECANISMO DE DEFENSA El ensayo es valido solamente si:
El control negativo es negativo
Se ha confirmado la sensibilidad del LAL con la serie de estándares
Si en el ensayo, el control positivo es positivo
El producto pasa si da negativo RESULTADOS + + + -- -- -- + + + -- -- -- + + + -- -- -- 1 0.5 0.25 0.125 0.06 C(-) + + + -- -- -- Una vez se tenga determinada la dilución del producto deseada, se procede a realizar por cuadriplicado la validación
Se debe realizar con tres lotes diferentes
No olvidar el Control negativo 4. VALIDACION DE PRODUCTO Cationes Divalentes
Neutralizan carga negativa de endotoxina, incrementa agregación disminuyendo actividad/potencia
Sal excesiva puede inhibir reacción
Estrategia
Dilución
Agentes Quelantes
Quelantes - e.g. EDTA, heparina - enlazan cationes divalentes
Estrategias
dilución
no se recomienda la adición de cationes para compensar 4. VALIDACION DEL PRODUCTO
Conocer el producto 0.5 EU/ml 0.03125 EU/ml 0.0625 EU/ml 0.125 EU/ml 0.25 EU/ml threshold OD Tiempo de incubación fijo Gelación (fija) Densidad
óptica Método de Punto Final vs Método Cinético Los primeros estudios con la sangre del cangrejo herradura fueron realizados a finales del siglo XIX.
Bang describió una enfermedad bacteriana en el cangrejo herradura (1956).
Levin y Bang demostraron posteriormente que la endotoxina iniciaba la coagulación.
Watson et al., (1977) utilizó LAL para investigación y muestras ambientales. Enviando muestras a laboratorios farmaceuticos
Planes para la producción comercial del LAL avanzaron.
Avances de la FDA “Bureau of Biologics” para regulación y control del uso y manufactura del LAL.
El “Bureau of Medical Devices” publica procedimientos para el uso del LAL en el análisis de dispositivos médicos en el Registro Federal de 1977.
Associates of Cape Cod fue el primer fabricante de LAL en obtener la licencia del “Bureau of Biologics” en 1977. HISTORIA Y DESCUBRIMIENTO LAL Establecida por la FDA como prueba para determinación de endotoxinas principalmente en productos inyectables.
Esta prueba junto con la prueba de esterilidad definen la liberación de un lote de producto inyectable. PRUEBA LAL
(PRUEBA DE ENDOTOXINAS) MDV = 35 UE/mil / 0.0625 UE/mil = 560 Cuando la sensitividad del LAL es 0.0625 UE/ml
se incrementa MVD = 140 0.25 UE/ml 35 UE/ml producto A : limite de 35 UE/ml,
sensibilidad del LAL : 0.25 UE/ml

MDV = Ejemplo para el calculo de MDV - - + + 0.03 0.06 0.125 0.25 Concentraciones de Standard (EU/ml) l = 0.125 EU/ml
El punto final confirma la sensibilidad de la etiqueta
El error del ensayo es +/- un tubo de dilución
CALCULOS: ANTILOGARITMO DE: ( SUMATORIA DE LOS LOGARITMOS DE LOS ENDPOINTS/NUMERO DE REPLICAS DE LOS ENDPOINTS) 2. VALIDACION DEL ROTULO spike unspike 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
- - - - - - -
- - - - - - -
- - - - - - -
- - - - - - -
- - - + + + +
- - - + + + +
- - - + + + +
- - - + + + + Standa 0.25 0.125 0.06 0.03
+ + - -
+ + - - =0.125 UE/mil l Cont.. Ejemplo-Resultado gel-clot/
coágulo b-Glucano Factor Activado C Factor C Enzima de coagulación activada Factor Activado B/G Coagulina Enzima de coagulación Coagulógeno Factor G Factor B Endotoxina Cascada de Activación
del Lisado CTRL (-) Los tubos se invierten 180°, si hay formación de un gel firme
indica que es positivo de lo contrario el resultado es negativo LAL sensitiv. 0.125 (0.1 ml diluc)
+
(0.1 ml lal) 0.25 0.125 0.06 0.03 Las mezclas se llevan al baño termostato a 37°C por una hora. 2. VALIDACION DEL ROTULO 2 mil 0.1 ml de LAL a 0.1 ml de cada dilución en tubos de 10 x 75 mm Una vez se tengan las diluciones se procede a adicionar: 2 ml agua
0.06 UE/ml 2 mil 2 ml agua
0.125 UE/ml 2 mil 2 ml agua
0.25 UE/ml 2 mil 2ml agua
0.5 UE/ml 0.5 mil 4.5 ml agua
1 UE/ml 4.95 ml agua
10 UE/ml 50ml 1000 UE/ml 2. VALIDACION DEL ROTULO 1 Adiciono 0.2 ml de X
más 0.01 mil de 40l A cada tubo adiciono 0.1 mil de sln de endotoxina 0.5 UE/mil 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 Verificar que no haya inhibidores – Todo debe ser (+)
ej. Si utilizo un LAL de 0.25 UE/ml el spike debe ser de 2l (0,5 UE/ml)
Adiciono 0.01 ml de endotoxina standard de 10 UE/ml a 0.2 ml de muestra problema en el tubo de reacción 1
V1 x C1= V2 x C2
C1= V2 x C2 / V1
C1= 0.2ml x 0,5 UE/ml, / 0.01ml
C1= 10UE/ml SPIKE Adicionar 0,1ml de LAL a todos los tubos CONTROL (+) Control (-)= Agua 0.5 UE/ml 0.2 ml dil 1:250
+
0.01ml (10ue/ml)= 2 lambda Adicionar 0.1 ml dilución 1:250 a c/tubo Dilución producto 1:250, LAL l= 0.25 UE/ml,
≥2l =0.5 UE/ml (endotoxina) 5. ENSAYO DE RUTINA 0.2 ml X 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 Se adiciona a cada tubo 0.1 ml de agua libre de pirógenos Para ver que el producto no ocasione realces o estimulaciones – Todo debe dar (-)
Se sigue la misma metodología para las diluciones pero el producto no se contamina con endotoxina UNSPIKE
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