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Presentación Tesina Evaluacion de la Actividad Biologica de especies nativas para su uso en tecnologia alimentaria

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by

Lucre Corral

on 15 September 2014

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Transcript of Presentación Tesina Evaluacion de la Actividad Biologica de especies nativas para su uso en tecnologia alimentaria

EVALUACIÓN DE ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE ESPECIES VEGETALES NATIVAS PARA SU USO EN TECNOLOGÍA ALIMENTARIA
Alumna:

LUCRECIA CORRAL
Directora: Dra. MARÍA LAURA TERESCHUK
Co-Directora: Dra. MARIELA GONZÁLEZ
TRABAJO FINAL PARA OPTAR AL TÍTULO DE LICENCIADO EN BIOTECNOLOGÍA
Objetivo General
Evaluar la actividad biológica de especies vegetales nativas extraídas por métodos convencionales como la maceración con solventes orgánicos y EFS para su uso en tecnología alimentaria.
1- Realizar extracción de compuestos de las especies seleccionadas mediante tecnología
convencional y tecnologías “limpias” (EFS) y muestreo fitoquímico.
Objetivos Específicos
2- Determinar la actividad antimicrobiana y antioxidante de los extractos de las especies seleccionadas, para proyectar su uso en alimentos funcionales.
3- Evaluar la actividad antimicrobiana y capacidad antioxidante en forma comparativa de los extractos ya obtenidos por EFS.
Materiales y Métodos
Material Vegetal
" Realizar extracción de compuestos de las especies seleccionadas mediante tecnología convencional y tecnologías “limpias” (EFS) y muestreo fitoquímico"
Extracción convencional de compuestos fenólicos con solventes (EC)
Maceración en etanol 80% y etanol 50% hasta agotamiento de la droga y filtración
Concentración en evaporador rotatorio a presión reducida
Extracción por Fluidos Supercríticos (EFS)
Esquema del proceso
1. Vaso de presurización; 2. Baño de hielo; 3. Entrada de CO2; 4. Entrada de N2; 5. Válvula de salida del vaso; 6.Manómetro; 7. Celda de extracción; 8. Baño termostatizado; 9. Válvula de salida de la celda; 10. Restrictor; 11. Recipiente colector
Equipo de Extracción por fluidos Supercríticos, construido en su totalidad en los talleres de la Facultad de Agronomía y Agroindustrias (FAyA), UNSE.
4
3
1
2
5
6
8
7

9
10
Equipo de Extracción
Estudios Fitoquímicos
Prueba de Shinoda:
Prueba del Cloruro Férrico
:
Prueba de Dragendorff
:
Cromatografía en capa fina (TLC)
" Determinar la actividad antimicrobiana y antioxidante de los extractos de las especies seleccionadas, para proyectar su uso en alimentos funcionales"
Actividad Antimicrobiana
Actividad Antioxidante
Método de decoloración de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidracilo)
Determinación de Fenoles Totales por el Método de Folin- Ciocalteu
Resultados
Bioautografía Directa
Bioautografía de Capa en Agar o Inmersión de Bioautografía
Bioautografía de Contacto
Métodos Bioautográficos
(Método descripto por Rahalison
et al
(1991), con algunas modificaciones)
Preparación de placas cromatográficas
Activación del Microorganismos
Preparación del inóculo
Método
Revelado
32º-37ºC 24 hrs
25º-27ºC 72 hrs
10 mg/mL
Control (-) Etanol 80%
Control (+) Gentamicina 10 mg/mL
Ketoconazol 10 mg/mL
SF
Tween 80 0,005%
Tubo 0,5 escala Mc Farland
Tubo 0.5 de la adaptación de la escala
Mc Farland para esporas negras
(Bertucci y Vázquez,2008)
32º-37ºC 24 hrs
25º-27ºC 72 hrs
Solución en agua estéril 2.5 mg/mL de sales de tetrazolium (INT)
32ºC 2 hrs
Radical 1,1-difenil-2-picrilhidracilo
VIOLETA
AMARILLO
Ácido Gálico
475 nm
20 mg/ L
100, 50 y 10 mg/L
Baño María 30ºC
30 min
517 nm
Partes aéreas
La eficiencia del proceso viene dada por su rendimiento que se expresa en por ciento (%)
Infecciones
Intoxicaciones
Factores
Implícitos
Intrínsecos
Extrínsecos
ALIMENTOS FUNCIONALES
ESPECIES VEGETALES
Antimicrobianos
EXTRACCIÓN POR FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
Cuando sometemos un fluido a altas presiones y temperaturas se obtiene un estado diferente llamado estado supercrítico
INGREDIENTES FUNCIONALES
VEGETALES
FRUTAS
LECHES
MIELES, PROPÓLEOS
FAMILIA ZYGOPHYLLACEAE
FAMILIA SOLANACEAE
FAMILIA FABACEAE
ETAs
VENTAJAS

Temperaturas Moderadas
Alta volatilidad
Extractos más puros
Alta selectividad
Poder disolvente ajustable
Disolventes apropiados
Inversión inicial alta
Baja disponibilidad de equipos
Reducido desarrollo de diseños

APLICACIONES EN LA INDUSTRIA ALIMENTARIA
Obtención de antioxidantes
Desgrasado de cacao
Obtención de triglicéridos, colesterol,
ácidos grasos insaturados en leche

Extracción de aceites esenciales y aromas
Descafeinización de café y té
Larrea cuneifolia
Larrea divaricata
Plectrocarpa rougesii
Bulnesia schickendantzii
Prosopis alba
Zuccagnia punctata
Lycium chilense
Flavonoides
Antocianinas
Catequinas
Ácidos Fenólicos
Taninos
condensados
Polifenoles
Flavonoides
Estructura básico de subgrupos
Flavonol
Isoflavona
Relación estructura-actividad
El número y posición de los sustituyentes determina su actividad como antioxidante
Quercetina
Catequina
Compuestos Fenólicos
Metabolitos secundarios
Compuestos fenólicos en alimentos
Compuestos Polifenólicos
Asimilación de nutrientes
Síntesis de proteínas
Fotosíntesis
Defensa ante factores adversos del medio ambiente (patógenos)
Asociados al color, características sensoriales y nutritivas, propiedades antioxidantes de alimentos
Antocianidina
Extracción Convencional y Supercrítica
Tamizaje
Bulnesia schickendantzii
Zuccagnia punctata
Larrea cuneifolia
Larrea divaricata
Prosopis alba
Lycium chilense
Fabiana patagónica
Plectrocarpa rougesii
Estudios Fitoquímicos
Actividad Antimicrobiana de EFS
Perfil de compuestos fenólicos por Cromatografía en capa fina (TLC)
Antimicrobianos
Naturales
Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Enterococcus faecalis
Aspergillus niger
Radicales libres
Especies químicas que poseen uno o más electrones desapareados, lo cual las hace altamente inestables y reactivas.
Especies Reactivas de Oxígeno (ERO)
Oxígeno Molecular Basal
Radicales libres
Oxígeno Molecular Singulete
Efecto benéfico sobre
el organismo
Mejora el estado de salud
Reduce riesgo de enfermedades
Aporta sustancias con
funciones fisiológicas definidas
Fabiana patagónica
1 mL
0,5 gr Limaduras de Mg
HCl
Isoflavonas, chalconas y auronas NO dan coloración.
Flavonas y flavonoles dan coloración
amarilla
a
rojo.
Flavanonoles
rojo
a
magenta
.
Flavanonas
rojo
,
magenta
,
violeta
,
azul

0,5 ml
Caracterización de flavonoides
Presencia de taninos y flavonoides
Sin cambio de color significativo, no se detectan taninos.
Cambio de color a
azul
, negro azulado, taninos pirogálicos (hidrosolubles)
Cambio de color a
verde
, azul verdoso, precipitado negro verdoso, taninos de tipo catecol (condensados)

Tolueno: Acetato de Etilo: Dietilamina
(70: 20: 10)
Solvente de desarrollo:
Solución:
1 mL reactivo de Dragendorff
2 mL Ácido Acético Glacial
10 mL Agua Destilada
Cambio de coloración a
anaranjado
, presencia de alcaloides
Solución 10 mg/mL
EC EFS
Tolueno-Acetato de Etilo-Ácido Acético-Metanol 4:1:1:1
Revelado
Método Físico
Método Químico
Flavonoles:
Quercetina, Miricetina y sus glicósidos:
Naranja
-
Amarillo
Kaempferol, Isoramnetina y sus glicósidos:
Amarrillo
-
Verde
Flavonas:
Luteolina y sus glicósidos:
Naranja
Apigenina y sus glicósidos:
Amarrillo
-
Verde

Prueba de Shinoda
Folin-Ciocalteu modificado por Tawaha
et al
,2007
Curva de calibración de ácido gálico
765 nm
Fuente
Flavonoides
(Flavonoles, Flavanoles
Flavanonas, Flavonas)
Arándanos, uvas, frutillas, frutas cítricas,lechuga,tomates,cebolla, café,chocolate,cereales, vino, té
Ácidos Fenólicos
Damascos,duraznos,arándanos, zanahorias,peras,cereales,ciruelas, tomates, espinacas, aceites de semillas
Taninos
Manzanas,uvas,duraznos,ciruelas, peras,frambuesas, granadas
Catequinas
Té,vino tinto
Lignanos
Sésamo,trigo,cebada
Prueba de Cloruro Férrico
Lycium chilense (EC)
Lycium chilense (EFS)
Zuccagnia punctata (EC)
Zuccagnia punctata (EFS)
Actividad Antimicrobiana de EC
Z.p.
L.c.
P.a.
L.d.
Ly.c.
F.p.
Z.p.
L.c.
P.a.
L.d.
Ly.c.
F.p.
+
-
L.cuneifolia
L.divaricata
P. alba
L.chilense
Z.punctata
F. patagónica
Staphylococcus aureus
(EFS)
+
-
Aspergillus niger
Z. punctata
(EC)
Z. punctata
(EFS)
EC y EFS
+
-
L.cuneifolia
L.divaricata
P. alba
L.chilense
Z.punctata
F. patagónica
Escherichia coli
(EFS)
Enterococcus faecalis
(EC y EFS)
Z.punctata
(EC)
Z.punctata
(EFS)
-
+
L.divaricata
(EC)
L.chilense(EFS)
P. alba(EFS)
L.cuneifolia(EFS)
L.divaricata(EFS)
Método de decoloración de DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidracilo)
Comparación de la Actividad antirradicalaria para EC y EFS a 100 mg/L de Extracto.
Determinación de Fenoles Totales por el Método de Folin- Ciocalteu y su correlación con la actividad antirradicalaria
Contenido de Fenoles Totales y porcentaje de decoloración de DPPH a 100 mg/L de los EC.
Actividad Antioxidante
Conclusiones
Colecta realizada en Amaicha del Valle, 2009 y 2013
Los mejores rendimientos de extracción se obtuvieron con EFS, con valores que oscilan entre 30-50%.
Todos los extractos dieron positivos los tests fitoquímicos para flavonoides, excepto
Lycium chilense
(EFS negativo para taninos y flavonoides).

Los extractos de
L.chilense
y
F. patagónica
(Solanaceae)dieron positivos el test para alcaloides.

La única especie activa frente
A.niger
fue
Z. punctata.

Los extractos fueron mas activos frente a microorganismos Gram (+)que a los Gram (-), y los EFS fueron mas efectivos que EC.
Mientras los porcentajes de decoloración de EC fueron mayores al 80 %, los porcentajes para EFS fueron variables.
El bajo comportamiento antirradicalario de
P. alba
y
L. chilense
puede deberse a que EFS no extrajo los compuestos responsables de esta actividad.

La cinética de la actividad antioxidante de compuestos menos polares muestra una excelente actividad en EC de
L.divaricata,
no así en EFS.

P. alba, L.cuneifolia, L.chilense
y
Z.punctata
mostraron actividad antioxidante que presenta valores interesantes en beta- caroteno.

La técnica por fluidos supercríticos (Tecnología “limpia”) se presenta prometedora a los fines de usar en el estudio de estos productos naturales.

¡Muchas Gracias!
Fueron identificados por el Lic. Alberto Slanis
Especímenes depositados en Herbario de la Fundación Miguel Lillo (LIL)
Compuestos Fenólicos
Flavanona
"Tecnologías Limpias"
Antioxidantes
LIMITACIONES
Z.p.
L.c.
P.a.
Z.p.
L.c.
P.a.
EC
EFS
L.c.
L.d.
P.a.
Ly.c.
Z.p.
F.p.
L.c.
L.d.
P.a.
Ly.c.
Z.p.
F.p.
Chalcona
Contenido de Fenoles Totales y porcentaje de decoloración de DPPH a 100 mg/L de los EFS
TECNOLOGÍA ALIMENTARIA
Toda sustancia que hallándose presente a bajas concentraciones respecto a las de un sustrato oxidable, retarda o previene la oxidación del mismo.

UNSE
UV 365 nm
(ANMAT)
Revelado Químico (NP)
EC
EFS
El bajo contenido fenólico y alta inhibición de radicales DPPH se debe a que otros compuestos pueden reaccionar con el reactivo F-C.
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