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Métodos de extracción del ADN

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Nadya Chura

on 2 June 2014

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Métodos de extracción del ADN
MEMBRANA SÍLICA GEL
(cromatografía de adsorción)

• Sangre
• Semen
• Saliva
• Dientes
• Folículo capilar
• Huesos
• Tejidos momificados
• Heces
¿De donde se puede extraer ADN ?
Clonación
¿Para qué?
O también llamado cromatografía de adsorción

Método de membrana de sílica
Como sabemos, el ADN esta cargado negativamente debido a los grupos fosfato, por lo que también esta recubierto por una capa hidratante al establecer de nuevo interacciones con ésta por puentes de hidrógeno.
Por lo tanto, estas dos estructuras deberían impedir la interacción entre ambas moléculas (el ADN y el vidrio o la membrana de sílice):
¿Como es posible entonces que el experimento de Vogelstein funcionara?
Por lo tanto, las sales caotrópicas atraen las moléculas de agua y eliminan la capa hidratante que recubre las diferentes biomoléculas
PCR
Secuenciación
Esta técnica de purificación se descubrió hace unos 30 años por un investigador llamado
Bert Vogelstein
Él demostró por primera vez en 1979 la unión del ADN al polvo de vidrio en presencia de yoduro sódico
La estructura molecular del vidrio es de tetraedro debida a la composición de SiO4, que establece puentes de hidrógeno con el agua, por lo que toda la superficie esta recubierta de una capa hidratante.
La biología molecular es una de las herramientas más útiles de las que se vale hoy en día la ciencia y la medicina moderna.


La obtención de ácido desoxirribonucleico (ADN), es el punto de partida para la mayoría de análisis genéticos; incluso contando con pequeñas cantidades de ADN, es posible amplificar genes específicos in vitro a través de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Publicó dos nuevas técnicas para separar y purificar fragmentos de ADN de geles de agarosa
Una es la preparativa y la otra analítica. La que veremos es la primera:
La técnica preparativa
esta utiliza la unión de ADN al vidrio en presencia de NaI. El método es rápido y conveniente, y el ADN de todos los rangos de peso molecular se puede recuperar con un alto rendimiento y sin degradación.
Nacido en 1949 en la ciudad de Baltimore, en el estado de Maryland.
Vogelstein es una una de les principales referencias en investigación oncológica por sus trabajos en la identificación y caracterización de los genes cuya alteración causa el cáncer de colon. Descubridor del gen APC, que controla el mecanismo de crecimiento celular en el colon
Gracias a la presencia en el experimento de un componente esencial sin el cual nunca se habría podido producir la reacción:
el yoduro potásico
.


Este compuesto es una
sal caotrópica
y este tipo de sales desestabilizan la estructura de las moléculas de agua, es decir, la capa hidratante que recubre a las biomoléculas, y debido a ello, desnaturaliza las proteínas, incrementa la solubilidad de sustancias apolares y destruye las interacciones hidrofóbicas
Lo cual permite que dichas moléculas (membrana de sílice y ADN) interactúen por medio de diferentes mecanismos)
Por lo tanto, el mecanismo de purificación de estos kits se basa en la adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas.


El sodio juega un rol como un catión enlazante o puente que atrae el oxígeno cargado negativamente en los fosfatos de las cadenas de ácidos nucleicos.

Tejidos fijados y parafinados también pueden ser procesados por este método previa desparafinación de la muestra. Si es la primera vez que se procesa una muestra de tejido FFPE se aconseja no utilizar más de 3 cortes de un grosor de 10 μm.
Alcance
Cuando se utiliza una columna para la purificación de ácidos nucleicos es importante no saturar la capacidad de la columna de unir ácidos nucleicos debido a un exceso de muestra. De hecho, el rendimiento y la calidad del ADN (o ARN) obtenido con este método depende en gran medida de la cantidad y calidad de la muestra de partida.
Este método puede ser utilizado para la obtención de ADN de los siguientes tipos de muestra:
Células mononucleares de sangre periférica (CMSPs): las preparaciones de CMSPs pueden tener un volumen variable puesto que se pueden procesar desde 5x 106 leucocitos hasta cantidades de 1x108 leucocitos, siempre y cuando se opte por el kit con la capacidad de carga de la columna más adecuado a la cantidad de muestra de partida.
Sangre periférica: existen kits con columnas de sílice con diferentes capacidades de retención de tal manera que se pueden procesar volúmenes que oscilan entren 0,02 ml y 10 ml de sangre.
Células: el número de células que pueden ser procesadas depende en gran medida del tipo celular, por lo que si se utiliza este método por primera vez, se recomienda no cargar la columna con más de 1x10^7 células
Saliva: muestras recogidas en torundas o en recipiente con preservante Oragene®.
Tejidos para tejido fresco congelado se aconseja no superar los 25 mg de muestra por columna aunque la cantidad de partida depende mucho del tipo de tejido que se va procesar.
Protocolo general
Paso 1. En primer lugar se lleva a cabo la lisis de la muestra (proteinasa K) seguido de una incubación con calor hasta que se completa la lisis. Puesto que no todos los kits desarrollados con esta técnica funcionan de la misma manera se aconseja seguir las instrucciones específicas de cada kit para el tipo concreto de muestra que se vaya a procesar
Paso 2. Si se desea obtener una muestra libre de ARN se debe añadir RNAsa a la solución de lisado. En muestras de sangre la contaminación por ARN resulta despreciable por lo que éste es un paso que habitualmente no se lleva a cabo.

En otros tipos de muestra donde la presencia de ARN puede ser alta se recomienda añadir RNAsa siguiendo las indicaciones del kit que vaya a ser utilizado.
Paso 3. Se añade a la muestra una solución de unión de ácidos nucleicos a la columna. Puede ser una solución provista por el kit o etanol absoluto. La mezcla se aplica a la columna de sílice que se encuentra adaptada a un tubo vacío y mediante centrifugación el ADN queda retenido en la columna mientras que las proteínas y otros contaminantes de la muestra son arrastrados con la solución de lisado al tubo.
Paso 5. Se transfiere la columna a un nuevo tubo y se lleva a cabo una nueva centrifugación a la máxima velocidad posible (durante 1-2 minutos) para asegurar una eliminación completa de los restos de la solución de lavado de la columna previamente a la elución del ADN.
Paso 6. La columna se transfiere a un nuevo tubo con tapa y se lleva a cabo la separación del ADN de la columna de sílice añadiendo H20 o un tampón de baja fuerza iónica. Se aconseja un tiempo de incubación de la columna con el tampón de resuspensión de 4-5 minutos para aumentar el rendimiento de ADN. Por último, se realiza una centrifugación que permite la colección del ADN en solución en el tubo y se desecha la columna.
Paso 4. Sobre la columna, que se ha transferido a un nuevo tubo, se añade una solución de lavado para eliminar el resto de contaminantes de la muestra que son arrastrados en esta solución por centrifugación. Este paso suele repetirse dos veces para asegurar una buena pureza de la muestra.
ESPECIFICACIONES PARA DIFERENTES TIPOS DE MUESTRA.
Muestras de sangre total
: para este tipo de muestras es necesaria la realización previa de una lisis selectiva de glóbulos rojos.
Para ello se añaden tres volúmenes de una solución de lisis de glóbulos rojos al volumen inicial de sangre total a lisar. La muestra se mezcla por inversión y se deja actuar durante 5 minutos.
Posteriormente se procede a una centrifugación para precipitar los leucocitos de la muestra que quedan pegados en el fondo del tubo mientras que el sobrenadante que contiene los glóbulos rojos lisados se elimina por decantación.

Esta lisis adicional de eritrocitos también puede realizarse sobre muestras de células mononucleares de sangre periférica (CMSPs) si se observa presencia de glóbulos rojos en la muestra.

Muestras de saliva: previamente al procesamiento de las muestras de saliva recogidas en un recipiente con preservante Oragene® se recomienda una incubación de la muestra a 50ºC durante 1-2 horas con objeto de optimizar el rendimiento final de ADN obtenido.
Muestras de tejido: las muestras de tejido deben ser homogeneizadas para que las células queden más expuestas a la acción de los reactivos.
Debido a que el proceso de disrupción del tejido conlleva la liberación de proteasas y otras enzimas involucradas en procesos de degradación de distintos componentes celulares, es habitual la utilización de inhibidores enzimáticos para evitar la degradación celular durante el proceso.
En el caso de preparaciones de tejidos FFPE es necesario eliminar la parafina de la muestra en el mayor grado posible previamente a la extracción de ADN. Para ello se realizan lavados de la muestra con xilol (o algún otro tipo de solución de desparafinación) y etanol.
CALIDAD DE LAS MUESTRAS.
Integridad:
las muestras obtenidas a partir de sangre, células y tejido fresco congelado presentan una integridad muy alta con la presencia de una banda de ADN definida en la parte superior del gel de agarosa.
Pureza
: este método permite obtener muestras de una gran pureza.
Funcionalidad:
las muestras que presentan una banda definida en la parte superior del gel de agarosa son capaces de amplificar por una reacción de PCR un fragmento > 17.5 kb. En muestras de ADN de saliva o de células fijadas en medio de Carnoy no siempre se logra amplificar fragmentos >17.5 kb. No obstante, en la mayoría de los casos se logra amplificar fragmentos de ADN de aproximadamente 5- 7 kb.
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