Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Copy of Copy of MONOKLONAL ANTİKOR ÜRETİMİ

son sunum
by

Hüseyin Mutlu

on 28 May 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Copy of Copy of MONOKLONAL ANTİKOR ÜRETİMİ

MONOKLONAL ANTİKOR ÜRETİMİ
Monoklonal Antikorların Tarihçesi
Monoklonal antikorların elde edilme yöntemi 1975'te César Milstein, Georges Köhler ve Niels Jerne tarafından tanımlanmıştır.( Hibridoma Teknolojisi)

Roscoe ve Owsianka (1982)' nın yapmış oldukları çalışmanın bulgularına göre, aljinatın insan tümör hücresi kolonizasyon testinde uygun bir alternatif olarak kullanılabileceği karşımıza çıkmaktadır.

Ayrıca, Kupchik ve ekibinin (1983) yapmış oldukları çalışmaya göre, insan tümör hücre hatları kalsiyum aljinat boncuklar içerisinde prolifere olabilmekte ve aynı zamanda karsinoembriyonik antijen ekspresyonlarını sürdürebilmektedirler (Sinacore et al., 1989).
Monoklonal Antikorların Tipleri
Günümüzde oluşturulan antikor tipleri
• Murine mAb: Tamamıyla fareden üretilen antikorlar (%100 fare proteini)
• Kimerik mAb: Değişken bölümleri fare kaynağından, sabit bölümleri insan kaynağından oluşturulan antikorlar (%33 fare proteini)
• Humanized mAb: Sadece antijen bağlayan bölgesi (ayrıca CDR=complementarity determining regions olarak da isimlendirilir) fareden, geri kalan değişken ve sabit bölgeleri insan kaynağından oluşturulan antikorlar (%5-10 fare proteini)
• Human mAb: Tamamıyla insan kaynağından gelen antikorlar (%100 insan proteini).

Kültürde 10^7 hücre/ml vardır.Adapte olmuş hücreler;2×10^6⁄(ml dir.)

10^6 hücre⁄ml (20-70 mg)⁄l.gün MAb üretir.

Hücre verimi=3.5×10^(-8)mg MAb⁄(hücre.gün)

T-flasklardan gelen hücre roller bottle'lara aktarılır.Besiyeri olarak 11.4 l/kesikli inoküle medya kullanılmaktadır.Çalışma hacmi 2.2L’dir. Çalkalamalı torba biyoreaktörü Roller bottle'dan gelen hücrelerin homojenizasyonunun ve havalandırmasının iyi yapıldığı bir sistemdir. Tek kullanımlık reaktör tipidir. Besi yeri olarak kesikli üretim başına 43.6 l/kesikli inoküle medya kullanılmaktadır. Çalışma hacmi 100L’dir. Kültür süresi 48 saatdir.
Monoklonal Antikorlar
Antikor : Hastalığa neden olan etkenleri zararsız duruma getirmek için vücudun ürettiği maddeye Antikor denir.

Epitop: Antikorların antijende bağlandıkları bölgedir. Her antikor bir epitopa spesifiktir. Böylece her antikor her antijene bağlanamaz.

mAb : monoklonal antikorlar sadece bir epitopa karşı reaksiyon gösteren antikorlardır ve sadece bir adet B – lenfosite dayanan hücre klonundan elde edilirler.

Hibrodoma Hücresi:Sonsuz bölünme yeteneğine sahip tümör hücreleriyle antikor üretilebilen memeli hücrelerini kaynaştırılarak oluşturulan, sürekli olarak antikor üreten 'hibrodoma' adı verilen hücrelerdir.


Niçin Monoklonal Antikor?
Hastalıklarla savaşım sağlayan antikorların büyük miktarlarda ve saf olarak elde edilmesi, uzun süredir bilim insanlarını peşinden koşturan bir hedeftir. Kullanılan klasik yöntem; laboratuar hayvanlarına antijen verilmesi sonrasında oluşan antikorların toplanmasıdır.

SEDA ÖZAYDIN
UĞUR ÖZEK
ATIFCAN DEMİRCİOĞLU
HÜSEYİN MUTLU
MONOKLONAL ANTİKOR ÜRETİMİ
HİBRİDOMA HÜCRELERİ
Mab üretimi, Hibridoma hücre hattının 225 mL’lik T-flasklar içerisine inoküle edilip, bu hücrelerin kültür ortamına adaptasyonlarının sağlanması ile başlar. Hücre kültür süresi 4 gündür. Besi yeri olarak kesikli üretim başına 3.4 l /kesikli medya kullanılmaktadır.
Aşı biyoreaktörü, çalkalamalı torba biyoreaktörden gelen hücrelerin metobo-
lizmasının mAb üretimini sağlayacak şekilde inoküle edildiği reaktörlerdir. Besi yeri olarak kesikli üretim başına 17L/kesikli inoküle medya kullanılmaktadır. Reaktör hacmi 100L, çalışma hacmi 75.79 L’dir. Kültür süresi 4 gündür. Üretim biyoreaktör Terapötik monoklonal antikor (mAb) üreten hücrelerin mAb üretmesi için kullanılmaktadır.


Toplam üretilmek istenilen mAb miktarı, 15 kg'dır.
Çevrim başına düşen mAb miktarı;15 kg/80 çevrim= 0.1875 kg mAb elde edilir.

alt akım prosesinden;
çıkan mAb miktarı(kg) = 0.1875 kg giren mAb miktarı(kg) = x kg olsun.
giriş MAb miktarı(kg) = (100*0.1875)/63.2 = 0.2967 kg mAb

alt akıma giren ( l/kesikli ) değerini ana prosesten yola çıkarak bulunur;
15308.75 l/kesikli 30.54 kg MAb ise
X l/kesikli 0.2967 kg MAb buradan X = 148.73 l/kesikli

Prot.A kromatografisi Antikorların bağlandığı, konakçı hücre proteinleri, hücre kültür ortamı bileşenleri ve var olan virüsler gibi istenmeyen bileşenlerin kolondan (Ph 6-8’de) uzaklaştırılması esasına dayanır. %90 verim ile gerçekleşir. 27 saat sürer. Protein ve kovalent bağlı kromatografi matrisine bağlanmış özel bir ligand arasındaki etkileşimin tersinir temelinde proteinleri ayırır. Bu aşamadan sonra antikor, ürün proteazları ile bozulmaya neden olabilir diğer ortam bileşenlerinin giderilmesi nedeniyle son derece saf ve daha kararlıdır.
IEX kromatografisi 3 döngüde gerçekleşir. Verimi %90’dır. 22.3 saat sürer. Yüksek molekül ağırlıklı agregatların, DNA ve konak hücre proteinlerinin, Protein A liçinin ve viral parçacıkların uzaklaştırılması için kullanılır. Temel izoelektrik noktasına sahip olan bir antikor için, katyon değişim kromatografisi kullanılabilir. IEX maddelerin iyonik grupları ile iyon değiştirici iyonik grupların eşdeğer miktarlarının karşılıklı yer değiştirmesi için uygulanır.
Iyon değişim kromotografisinde kullanılan reçinenin bağlama kapasitesi, reçinenin litresi başına ürünün 40 g’ıdır.

Konsantre edilmiş protein çözeltisi, kimyasal olarak virüsleri inaktive etmek için Polisorbat 80 ile 1.5 saat boyunca muameleye tabi tutulur.Polisaj filtreleri iyon değişim kromatografisinden çıkan akımda var olan partikülleri uzaklaştırmak amacıyla kullanılmaktadır. Polisaj filtrelerinin giriş akım debisi ve çıkış akım debisi 9,3982 L/ kesikli olmaktadır.


Viral uzaklaştırma aşaması 0.02 mikrometrelik gözenek boyutuna sahip bir filtre ile yapılır. Fiziksel bir ayırma işlemidir. 0,02 mikrometreden küçük olan partiküller uzaklaştırılmaktadır. Buna bağlı olarak çok büyük bir hacim değişimi olmadığından dolayı ağırlık kayıpları ihmal edilmiştir. Çıkış akımındaki mAb konsantrasyonu 0,1993 kg /kesiklidir.
IEX kromatografisi 3 döngüde gerçekleşir. Verimi %90’dır. 22 saat sürer. Yük, boyut ve afinitelerine göre proteinleri ayırmak için kullanılır. IEX sonrasında polisaj adımı olarqak kullanılır. Agregatların büyük bir kısmının giderilmesinde etkilidir. Antikordan ilgili yabancı maddelerin ayrılmasını sağlar. Konakçı hücre proteini DNA ve agregatların çoğu uygun elüsyon tamponu seçimiyle üründen uzaklaştırılır.
Hidrofobik etkileşim kromotografisinde kullanılan reçinenin bağlama kapasitesi, reçinenin litresi başına ürünün 40 g’ıdır.
Dead end Filtration Tüm besleme akımı, bir membran boyunca uygulanır ve süzülen madde, membranın yüzeyi üzerinde birikir, biriken madde uzaklaştırılır.Düşük partikül hacmi ve düşük konsantrasyon gradientlerinin olduğu durumlarda kullanılır. Genel olarak bir polisaj adımıdır. Hidrofobik etkileşim kromotografisinden gelen akım ölü hacim filtrasyonundan geçer. Giriş ve çıkış akımlarının kütlesel bileşimleri değişmemektedir. Çıkış akımındaki mAb konsantrasyonu 0,1993 kg/kesikli ‘dir.
Değişen debileri ve konsantrasyonları dengelemek için kullanılır. Dengeleme tankı, fermentörden santrifüje hızlı deşarj ve gerekli hızda aktarım sağlar. Giren akımın kütlesel bileşimi 0,2967 kg/keskli mAb, 148.68L/ kesiklidir.Giren akım burada dengelendikten sonra yığın disk santrifüje geçmektedir.
Üretilen biyokütle ve diğer süspansiyon halindeki bileşikler, birbirinden uzaklaştırılır. Bu adım sırasında yaklaşık %5 mAb katı atık akışında kaybolur. %95 verim ile gerçekleşir. Çalışma çizelgesi dengeleme tankının çıkış akımı transferi ile başlar. Yığın-Disk santrifüj, hücre enkazı parçacıklarının büyük kısmını uzaklaştırmak için kullanılır. Tipik olarak iki faz arasındaki yoğunluk farkı esas alınarak, katı-sıvı veya sıvı-sıvı ayrımını gerçekleştirmek için kullanılır. Dengeleme tankından gelen akım, yığın disk santrifüje girer, yığın disk santrifüjde %95 verimle katı atık giderilir. Aynı zamanda %5 lik bir mAb kaybı vardır. Kalan hücre enkazı uzaklaştırılır. Polisaj filtreleri protein – A kromatografisinden çıkan akımda var olan partikülleri uzaklaştırmak amacıyla kullanılmaktadır. Polisaj filtrelerinin giriş akım debisi ve çıkış akım debisi 148.73L/ kesikli olmaktadır.

ALT AKIM PROSESİ
Polisaj filtreleri protein – A kromatografisinden çıkan akımda var olan partikülleri uzaklaştırmak amacıyla kullanılmaktadır. Polisaj filtrelerinin giriş akım debisi ve çıkış akım debisi 46.,98 kg/ kesikli olmaktadır.Diafiltrasyon %97 verimle gerçekleşir. 8.4 ssat sürer. Bir diafiltrasyon için tanımlanan gözenek boyutu 0,45 mikron olan DftRO membranıdır.
Diafiltrasyon işleminde su, çözücü madde ya da tampon maddesi ile filtrasyon sırasında, su (ya da başka bir çözücü) ile birlikte membrana nüfuz eden bileşenlerin uzaklaştırılması kolaylaştırılır. Depolama tankına gelen akım diyafiltrasyona gönderilir ve burada %3 ‘lük bir mAb kaybı olmaktadır.

Final polisaj filtrelerinde var olabilecek kontaminasyon kaynakları ve küçük partiküller
uzaklaştırılmaktadır. Burada mAb kaybının olmadığı kabul edilmiş ve hacim değişimi çok büyük olmadığından ağırlık kayıpları ihmal edilmiştir. Çıkış akımındaki mAb konsantrasyonu 0,1875 kg/ kesikli ‘dir. Final polisaj filtrelerinden çıkan ürün dondurma tankına alınarak liyofilizasyona tabi tutulur ve daha sonra paketleme bölümüne alınarak 100 ml ‘lık paketlerle çıkış ürünü alınır.

Gözenek boyutu 0.45 mikrometre, operasyon süresi 20 saat ve 0.24 metrekarelik membran.
Depolama tankına gelen akım diyafiltrasyona gönderilir ve burada %3 ‘lük bir mAb kaybı olmaktadır.Protein çözeltisi 1.5 kat konsantre edilir.

• Yeni bir üretim tesisi yapılmış ve 15 kg / yıl mAb'nin üretimi için tahsis edilecektir.
• Tüm direkt sabit sermaye yatırımları 12 yıllık bir süre boyunca doğrusal amortismana tabi tutulacaktır.
• Proje ömrü 16 yıldır.
• WFI birim maliyeti 0,15 $ / l'dir.
• Serumsuz ortam maliyeti 300$ /kg ‘dır.
• Kullanılan tüm kimyasallar yüksek saflık derecesine sahiptir.
• membranların birim maliyeti 400$/m2 ‘dir.
• Kromatografi reçinelerinin birim maliyeti sırasıyla C-101, C-102 ve C-103 sütunları için 6000 $ / L, 1200 $ / L ve 2050 $ / L’dir.
• Kromatografi reçineleri sırasıyla C-101, C-102 ve C-103 sütunları için her 60, 50 ve 50 devirde bir değiştirilir.
• Üst akıma 148.61 lt alt akıma 1342.71 lt wfi gitmektedir toplamda 1491.31 lt wfi gitmektedir. WFİ maliyeti 223.698 dolar/ çevrim dir.
• Toz medium 2.526 kg gereklidir, 3 kg toz mediumun maliyeti 178200 euro/çevrim dir. Çevrimde harcanacak medium kontaminasyon , dökülme kaza vb. gibi durumlara karşı fazladan istenmiş ve 2.526 kg/çevrim den 3 kg/çevrim değerine çıkarılmıştır.
• T – flaksların (25 cm2 ) 100’lük paketi 350 euro’dur .Roller bottle 2 lt lik 1 adet ; 240 dolardır. 9 adet roller bottle kullanılacaktır

Maliyet

ÜST AKIM PROSESİ
ALT AKIM PROSESİ
ENERJİ GİDERLERİ
670 lt hacime sahip bir soğutma ekipmanına gerekli bağlantılar yapılarak tüm sistemdeki depolama tankları tek bir soğutucu oda kullanılarak soğutulabilir . 700 lt lik bir soğuk odanın gücü 0,3 KW tır . Ki bu saatte 0,3 KWh harcayacağı anlamına gelir . Ortamala fiyatları piyasada 4000 lira ila 15 000 lira arasında değişmektedir istenilen kaliteye göre değiştirilebilir.
26 adet pompaya ihtiyaç vardır , ayrıca enjeksiyonluk suyun pompalanması için 2 tane ve saha yıkaması ve ekipman yıkaması için 3 adet pompaya ihtiyaç vardır . Toplam proseste 31 adet pompaya ihtiyaç duyulur . Palmera model pa15t pompaları fiyat olarak uygun olup tanesi 280 liradan 8680 lira maliyete sahiptirler. Ayrıca enerji giderleri enjeksiyonluk suyun yıkama suyu olarak kullanımı da işin içine dahil edildiğinde 35,4 kWh lik pompa enerji maliyeti oluşacaktır. (Ayrıca bu sistem 10 adet pompayla da kurulabilir fakat pompaların sterilizasyon kimyasallarıyla ektra yıkanmaları gerekir maliyet analizi gereği 31 adet pompa alınması uygundur.)
TEŞEKKÜRLER :)
UĞUR ÖZEK
SEDA ÖZAYDIN
HÜSEYİN MUTLU
ATIFCAN DEMİRCİOĞLU
1985 ve 2008 yılları arasında klinik çalışmaya katılan insan mAb'lerin kümülatif sayısı
scFV patent istekleri olan ülkelerin ana hedefleri
Üretim biyoreaktörü kesikli beslemeli modda çalışır. Besi yeri olarak kesikli üretim başına 72.89L/kesikli inoküle medya kullanılmaktadır. Hücre kültürü bölümünde, serumsuz düşük-proteinli medyum tozu, bir paslanmaz çelik tank (MP-103) içerisinde WFI (su enjeksiyonu) içinde eritilir. Çözelti, 0.2 µm'lik çıkmaz parlatma filtreleri ölü hacim polisaj filtreleri (DE-103) kullanılarak sterilize edilir. Reaktör hacmi 200L, çalışma hacmi 148.68 L’dir. Verimi %90, kültür süresi 288 saatdir.
Full transcript