Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

No description
by

Leslie Hluz

on 16 May 2016

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of MUTAGÉNESIS DIRIGIDA

MUTAGÉNESIS DIRIGIDA
Leslie Anahi H Luz Carreño
Es cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido o en la organización del ADN de un ser vivo, que produce una variación en las características de este y que no necesariamente se transmite a la descendencia.
Mutación
Según origen
Según tamaño
Espontaneas
Inducidas
Cientos o miles de pares de bases
Pocos pares de bases
Por un agente físico,
químico o biológico
Radiaciones o errores en
la replicación
Mutaciones inducidas
"Random" mutagénesis
Mutágenos químicos: Análogos de base, agentes alquilantes o intercalantes.
Radiación : Rayos X, UV
Mutagénesis dirigida
Técnicas de biología molecular
Primera aproximación: Charles Weissmann (1973)
Agentes biológicos: Virus y transposones
Los mutantes se crean al azar, el que nos interesa puede ser uno entre miles
La mutación se crea en un sitio definido de la secuencia de ADN
Método Hutchison & Smith (1978)
Hicieron un método más flexible
El método se basa en la amplificación del ADN
con una polimerasa utilizando cebadores (primers)
con la mutación deseada.
Fago M13: sistema de clonación para introducir fácilmente mutaciones en el gen clonado.
ssDNA circular
6400 pb
Es un fago filamentoso que infecta E.coli
Generar el fragmento/gen que queremos modificar
en forma de cadena sencilla (vector M13)

Diseñar/generar el "primer" con el cambio

Hacer la reacción de polimerización para generar el vector en forma de cadena doble

Se usa el fragmento klenow: actividad exonucleasa 3'->5' (no repara errores)

Replicación dentro de la bacteria

No todos los fagos tendrán la mutación

Con hibridación con una sonda podemos ver las calvas que contienen la mutación
Principal problema: baja eficacia
Protocolo
Método Kunkel (1986)
Objetivo: Mejorar la eficacia respecto al método de Fisher
Primeramente debemos tener nuestro gen de interés clonado en un plásmido o fago (M13)
2o paso: Amplificación con el oligonucleótido que contiene la mutación (puede ser deleción, inserción o cambio de base de uno o más nt) In vitro
3r paso: Transformación del plásmido híbrido a una bacteria wild type. Se destruye la cadena que contiene U. Queda sólo la copia mutada.
1r paso: Transformación de E. coli (ung-,dut-) con el plásmido o fago M13 (In vivo)
Es un método simple

No utiliza el fago M13

Se hace una reacción de PCR con 2 oligos que contengan la mutación y sean complementarios a las 2 cadenas de ADN

Se usa una polimerasa proof reading para asegurar que se copia todo el vector

El producto de la PCR se trata con DpnI (digestión de la cadena ADN metilado)

Los plásmidos mutantes se mantienen intactos
Se transforma en E.coli
Método PCR
Aplicaciones de la mutagénesis dirigida
Investigación

Evaluar la criticidad de un aminoácido concreto dentro de una proteína.
Cambiar un aminoácido por otro para ver el comportamiento de la proteína. (con mutagénesis al azar, el mutante deseado seria uno entre miles)

Ej. Directed evolution and targeted mutagenesis to murinize Listeria monocytogenes internalin A for a enhanced infectivity in the murine oral infection model.
Internalin A: factor de virulencia que media el inicio de la infección de Listeria
Se vió que el cambio en un aminoácido estaba relacionado con un gran aumento de la infectividad via oral.






Aplicaciones comerciales

Diseño de proteínas con la función y características deseadas.

Ej. Sublilisina (enzima usada en detergentes)
La forma wt contiene una Met que puede ser oxidada por la lejía
Puede ser sustituida por una Ala para que la enzima sea activa en las condiciones en las que se usa el detergente
George Smith descubrió que se puede modificar al M13 para obtener diferentes sitios de inserción accesibles, haciéndolo útil en su flexibilidad para el manejo de insertos de diferente tamaño.
Gen dut: codifica por una dUTPasa. Previene a la bacteria incorporar uracilo durante la replicación
Gen ung: codifica para la uracilo decarboxilasa. Elimina los uracilos que se han incorporado al ADN por error.
Fagémido
Full transcript