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Copy of Liquid Chromatography

Explanation of origins, principle and practice of HPLC, UPLC, SEC, etc.
by

Yves Casta

on 20 October 2015

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Transcript of Copy of Liquid Chromatography

Origines de la Chromatographie
Définition et fonctionnement
Le chromatographe
En 1906 le botaniste russe Mikhail Tswett est le premier à utiliser le terme chromatographie lorsqu'il rempli une colonne avec du carbonate de calcium pour séparer des pigments de plantes en fractions
jaunes
et
vertes
.
Les techniques de chromatographie sont définies comme l'ensemble des méthodes physico-chimiques utilisées pour séparer les constituants d'un mélange homogène (molécules ou macro molécules).

Des substances (analytes) dissoutes traversent une phase stationnaire, entraînées par un liquide ou un gaz, et interagissent avec d'autres substances qui constituent la phase stationnaire. En général, la phase stationnaire est localisée dans une colonne.

Le liquide/gaz qui entraîne les analytes à travers la colonne est appelé
PHASE MOBILE
.

Les particules solides/liquide dans la colonne sont nommées
PHASE STATIONNAIRE
.
Les instruments utilisés en chromatographie sont appelés
chromatographes
. Ils sont constitués de 3 parties principales: l'injecteur, la colonne et le détecteur.

Ce dispositif est complété par un réservoir de gaz (phase mobile) ou de liquide ainsi que d'un enregistreur qui traite les données.

De nos jours, les chromatographes sont capables de contrôler de manière très précise tous les paramètres qui ont une influence sur la migration des analytes (température, débits, composition des phases mobiles et stationnaires).

Par exemple pour la HPLC :

Dans les années 1950, Martyn et Synge utilisent un gel de silice associé à un solvant dans l'optique de séparer des acides aminés.
La Chromatographie
Hauteur équivalente à un plateau théorique H (HEPT)
La
Hauteur équivalente à un plateau théorique H
d'une colonne se calcule en divisant sa longueur L par son efficacité
N:
Chromatograpie sur couche mince (CCM)
On utilise cette technique pour effectuer une analyse rapide (souvent en cours de réaction). La phase stationnaire, polaire, est généralement un gel de silice déposé sur une plaque (verre ou aluminium). Les solvants usuels (! eau) sont utilisés en guise de phases mobiles.
Ils recoivent le prix Nobel de chimie en 1952 pour leur invention de la chromatographie de partage.
Principe de séparation
Les interactions avec la phase stationnaire freinent la progression des analytes.
Comme les interactions avec la phase stationnaires sont propres à chaque composé, certains se déplacent plus rapidement que d'autres. Chaque analyte est ainsi caractérisée par un
temps de rétention
(ou temps de migration).
Un mélange homogène peut ainsi être séparé en constituants individuels.

La chromatographie est une méthode d'analyse se basant uniquement sur la mesure des temps de rétention des analytes pour les identifier.
Principe de séparation
Chaque analyte est caractérisée par un
coefficient de partition K
:
Ce paramètre indique le ratio de concentration entre l'analyte qui se trouve dans la phase stationnaire et l'analyte qui se trouve dans la phase mobile. Une
valeur de K élevée
signifie que le composé est bien retenu
grand temps de rétention
.

K est dépendant de la température et des forces d'interactions.
Le chromatogramme
Chaque analyse correspond à un enregistrement nommé
chromatogramme
.

Le passage des analytes à travers le détecteur se traduit par un pic sur le chromatogramme.

Le chromatogramme est une représentation graphique qui montre la relation entre le temps et l'intensité du signal.

K majuscule !
Pics d'élutions parfaits
Un pic d'élution parfait correspond à la représention graphique de la courbe de Gauss.

En plus des temps de rétention, on utilise différents paramètres qui permettent de caractériser chaque analyte et comparer les performances des colonnes ou des séparations.

Efficacité
N
: nombre de plateaux théoriques, modèle adapté au modèle des années 1920 décrivant les distillations fractionnées utilisées dans l'industrie pétrolière.




Plus une colonne a un nombre de plateaux théorique élevé, plus l'efficacité à séparer un mélange d'analytes sera bonne.

Ce paramètre se calcule à l'aide du chromatogramme. De nos jours, les ordinateurs se chargent du calcul.
Les principaux paramètres
L'efficacité N
Plateaux d'une colonne de distillation fractionnée
H = L /
N
Ce paramètre H est très utile car il est indépendant de la longueur de la colonne.
Autres paramètres
Volume de rétention VR
: il s'agit du volume de solvant nécessaire à faire migrer un analyte d'un bout à l'autre de la colonne.
Volume mort VM
: désigne le
volume
de
phase mobile
dans la colonne. Si un composé n'est pas du tout retenu par la phase stationnaire, son volume d'élution est égal au volume mort.
où D est le débit de la colonne
Temps mort tM
: correspond au
temps
nécessaire à la phase mobile pour
traverser
la colonne. Si un composé n'est pas du tout retenu par la phase stationnaire, son temps d'élution est égal au temps mort.
Rapport de phase B : est le
rapport
entre le volume mort et le volume de la phase stationnaire. C'est un paramètre essentiel de toute les colonnes.
Facteur de rétention
Facteur de rétention k
: désigne le rapport entre la quantité du composé qui est liée à la phase stationnaire et celle en solution dans la phase mobile. Il correspond aussi au ratio des temps passés entre les 2 phases:
Cette caractéristique décrit la
capacité
d'une colonne
à retenir
les analytes. Plus le
k est grand
, plus l'analyte va être
retenue
. Il peut être déduit en lisant les chromatogramme.
Sachant que :
Facteur de sélectivité et de résolution
Facteur de séléctivité
alpha
: lorsqu'on est en présence de 2 analytes, le facteur de sélectivité correspond au rapport des facteurs de rétention. Ce paramètre indique l'aptitude d'une colonne à séparer deux composés:
Facteur de résolution
R
:
décrit la plus ou moins bonne séparation des pics. On l'obtient par calcul en lisant le chromatogramme:
Le facteur de séléctivité est toujours supérieur à 1!
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
La HPLC est une des méthodes chromatographique la plus fréquemment utilisée. Sa phase mobile est à l'état liquide.

Comparé aux méthodes chromatographiques classiques sur colonnes ou sur couche mince, la HPLC a de très nombreux avantages. Elle est en quelque sorte la "next generation".

Parmi ces avantages figurent :

La miniaturisation du diamètre des colonnes (économie de produit et de solvant).

La possibilité de fabriquer des colonnes garnies très compactes (haute pression nécessaire pour un débit suffisant).

Gérer les débits de manière très précise.

Possibilité de recycler pour améliorer la séparation des pics
Différentes méthodes chromatographiques
CCM : Chromatographie sur couche mince
Chromatographie
sur colonne
Chromatographie liquide haute performance (HPLC)
Chromatographie
gazeuse (GC)
Chromatographie d'exclusion stérique (SEC)
Phases stationnaires en HPLC
Les phases stationnaires en HPLC sont généralement composées de gels de silice qui sont composés de très petites sphères dont le rayon varie (généralement 5-10 micromètre). Le mécanisme d'action du gel de silice se base sur l'adsorption car les analytes sont liés à la surface du gel.
Les groupements silanols à la surface permettent de greffer chimiquement d'autres groupements fonctionnels (chromatographie de partage liquide-liquide). Ceci permet de changer la polarité à la surface du gel. Les gels C18 ou C8 (octadecyl ou octyl) sont garnis de groupement peu polaires, c'est une chromatographie en phase inverse. Les produits les plus polaires migrent plus facilement et sont récupérés en premier. A l'inverse, les substances les plus hydrophobes restent fixées plus longtemps sur la colonne. Cette méthode de phase inversée est la plus utilisée de nos jours.

Phases stationnaires en HPLC
Différence entre l'a
d
sorption et l'a
b
sorption
Phases mobiles en HPLC
En chromatographie en
phase normale
(phase stationnaire polaire), on
commence à éluer
avec une phase mobile
peu polaire
. Si l'on choisissait de commencer avec une phase mobile polaire, le solvant saturerait les groupements silanols du gel de silice et quasi toutes les analytes migreraient sans interactions et passeraient tout droit sans retenue.

Attention, le gel de silice est légèrement soluble dans l'eau.


Par opposition, en
phase inverse
, on opte pour une
phase mobile polaire
afin d'éviter de saturer les groupement non polaires. En phase inverse, l'ordre d'élution est opposé à celui obtenu en phase normale.

Les composés peu polaires migrent plus lentement avec des éluants polaires.

Les composés polaires sont peu retenus en phase inverse et sont donc difficilement séparables. On utilise des gradients d'élution particuliers pour y parvenir.

Un des gros avantages de la phase inverse est la possibilité de solubiliser des substances dans l'eau.
Chromatographie en phase normale
Chromatographie en phase inverse
Injecteurs en GC
Injecteur à vaporisation directe
: est l'appareillage conseillé pour les analyses quantitatives. Il s'adapte aux colonnes remplies et aux colonnes capillaires.

Injecteurs split/splitless
: Ils sont uniquement utilisés sur les colonnes capillaires. La particularité de l'injecteur split est de supporter les échantillons concentrés.
Techniques instrumentales d'analyse chimique en 23 fiches,
A. et F. Rouessac
, éditions DUNOD, 2011.

Source :
Chromatographie en phase gazeuse (GC)
La chromatographie en phase gazeuse est une technique ou les analytes sont chauffées à l'état de gaz avant d'être entraînées dans la phase stationnaire de la colonne par un
gaz vecteur
(
phase mobile
).

Les gaz employés sont souvent du dihydrogène, hélium ou diazote.

Ceci implique que les analytes doivent être volatiles et thermiquement stables.

Cependant, en raison de sa polyvalence et de sa sensibilité, la GC est très régulièrement utilisée.
Détecteurs
Les appareils de détections sont très nombreux et se basent sur des phénomènes divers.

Les plus utiles reposent sur le couplage de la HPLC avec des méthodes spectroscopiques. Comme par exemple la
HPLC-MS
qui permet d'obtenir des spectres de masse en plus du chromatogramme. Ainsi, on peut attribuer une masse moléculaire à chacun des pics ce qui facilite l'analyse.
Stratégies pour encore améliorer la séparation
La technologie actuelle permet de fabriquer des particules de phase stationnaires de très petites tailles (de l'ordre de 1 micromètre).



En raison du tassement de ces petites particules, il est nécessaire d'appliquer des
pressions
de liquide très
importantes
. Des pressions qui ne sont pas supportées par les appareils de HPLC.



C'est pourquoi, il existe actuellement des appareils de
UHPLC
(U signifie Ultra) qui supportent de très grosses pressions de liquide.
Injection
On injecte généralement les substances à analyser à l'aide d'un dispositif appelé boucle d'injection ou tout simplement à l'aide d'une seringue à travers un septum.


Boucle d'injection :

www.restek.com/Technical-Resources/Injector-Animations
Détecteurs en GC
Comme pour la HPLC, Les appareils de détections sont très nombreux et se basent sur des phénomènes physico-chimiques divers.

Les plus répandus et les plus performants allient la chromatographie avec des méthodes spectroscopiques. Comme par exemple la
GC-MS
qui permet d'obtenir des spectres de masse en plus du chromatogramme.
www.restek.com/Technical-Resources/Injector-Animations
Phases stationnaires en GC
Les phases stationnaires les plus fréquemment utilisées sont des dérivés de polysiloxanes.
Colonnes en GC
Il existe plusieurs sortes de colonnes dont :

Les colonnes remplies
: 3 à 6 mm de diamètre, de longueurs allant de 1 à 3 m, composées de verre ou d'acier. Ces colonnes sont remplies avec des particules poreuses et inertes sur lesquelles il est possible d'attacher de nombreuses phases stationnaires selon l'usage souhaité.

Les colonnes capillaires
: Elles sont généralement remplies de silice fondue et ont un diamètre interne compris entre 75 et 250 micromètres pour une longueur de 10 à 100 m. La phase stationnaire tapisse l'intérieur de la colonne avec une épaisseur allant de 0,05 à 5 micromètres.
On peut greffer toutes sortes de groupements fonctionnels pour faire
varier la polarité
et ainsi choisir la meilleure option selon les produits à analyser.

En greffant des fonctions chirales, on arrive à séparer des énantiomères.

Phases stationnaires en HPLC
On peut également greffer des entités chirales, comme par exemple des cyclodextrine, afin de séparer des énantiomères.

Chromatographie d'exclusion stérique (SEC)
On voit sur ce tableau que plus la valeur de H est petite, plus la colonne sépare de manière efficace.
Au niveau moléculaire, les substances ont toutes des géométries et des volumes différents. La chromatographie d'exclusion stérique permet de séparer des analytes selon les critères précédents. Cette méthode est très utile pour séparer des polymères, des macromolécules et même des molécules de faibles masses.

Les molécules de
petites tailles
, en vert, sont assez petites pour entrer dans les plus petits pores des particules de la phase stationnaire. Elles parcourent un chemin plus long et donc mettent plus de temps pour traverser la colonne.

Au contraire, les
grosses molécules
en rouges passent tout droit et sont ainsi éluées plus rapidement.

Chromatographie d'exclusion stérique (SEC)
Lorsque la phase stationnaire est
hydrophobe
, on l'associe à une phase mobile non polaire (solvant organique). On parle de
perméation de gel
.

A l'inverse, quand la phase stationnaire est
hydrophile
on utilise l'eau comme phase mobile. C'est la
filtration sur gel
.
Le coefficient de diffusion K indique la propension des analytes à entrer dans les pores. K est compris entre 0 et 1.

Les analytes dont le
K vaut 1 (petites molécules)

entrent dans tous les pores
et sont
retenues
par la phase stationnaire.

Lorsque
K vaut 0 (grandes molécules)
, les substances ne
pénètrent pas
du tout dans les pores et ne sont
pas retenues
par la phase stationnaire.
Chromatographie analyse quantitative
étalonnage externe
La chromatographie en phase gazeuse, grâce à sa
sensibilité
, est très intéressante lorsqu'il s'agit de doser des très
petite quantités
(traces) d'analytes.

Pour effectuer un dosage, il faut disposer d'un
échantillon
très
pur
de la substance à analyser qui sert de référence.

Les
aires
des pics du chromatogramme sont directement
proportionnelles
aux
masses d'analytes
injectées dans la colonne.

Il faut injecter des volumes égaux (Ceci est facilité par les injecteurs automatiques)!
Etalonnage interne
L'avantage est qu'avec un
étalon interne
,
pour doser des substances, les
volumes
injectés n'
interviennent plus
et on se débarrasse ainsi des erreurs instrumentales.
Supposons un dosage de 2 substances additionnée d'un marqueur E
Influence du débit de gaz sur la séparation
La vitesse de la phase mobile et par conséquent le débit de la colonne ont une grande influence sur l'efficacité d'une séparation.

Les courbes de Van Deemter montrent l'influence de la vitesse de la phase mobile sur l'HEPT (H) d'une colonne pour les 3 gaz régulièrement utilisés en GC.
Coefficients de réponse relatifs : pour 1 seule substance.

Le chromatogramme de gauche est celui obtenu après injection de la solution d'étalonnage dont les concentrations en 1 et E sont
connues
.
Étalonnage interne
Concentrations dans la solution à doser :

On additionne la solution à doser d'une quantité connue du marqueur E et on injecte la solution à nouveau.
K1/E est le coefficient de
réponse relatif
. Il ne
varie pas
d'une expérience à l'autre.
Ces petites sphères sont poreuses (diamètre des pores avoisine les 3 nanomètres) ce qui leur confèrent des surfaces énormes.
Différentes natures de chromatographies
L'échantillon à analyser, appelé aussi soluté ou analyte, est retenu par la phase stationnaire selon la nature de la chromatographie.


En
chromatographie

d'adsorption
l
'analyte subit un mécanisme d'
adsorption
sur une phase stationnaire solide et un mécanisme de désorption (élution) par la phase mobile liquide ou gazeuse. ****

En
chromatographie liquide de partage
, la phase stationnaire est constituée d'un film liquide, non miscible avec la phase mobile, fixé par des liaisons covalentes (phases greffées). Il existe des phases greffées polaires (phase normale) et des phases greffées apolaires (phase inverse).

L'analyte est retenu par des
forces électrostatiques
dans la
chromatographie d'échanges d'ions
. la phase stationnaire comporte des groupements ionisés (+ ou -).
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