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Untitled Prezi

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by

nihad khiat

on 25 November 2015

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Transcript of Untitled Prezi

II -Objectif
V- Conclusion
Cette étude fournit des preuves du rôle direct de ROS dans l'induction d ela croissance et le potentiel métastatique des cellules cancéreuses du sein. En outre, cette étude suggère que la résistance à ROS induite par des médicaments chimiothérapeutiques dans le cancer du sein pourrait au moins en partie être due à l'avantage de croissance sélective des cellules souches du cancer dans un environnement de stress oxydatif.
Ces résultats vont ouvrir une nouvelle voie pour la conception ou l'élaboration d'une nouvelle stratégie pour le traitement du cancer du sein en ciblant la signalisation redox à travers antioxydants.


IV- Discussion
III- Matériels et méthodes et résultats
1- Culture cellulaire et traitement
pour cette étude ils ont utilisés les cellules MCF-7 (ATCC) : une  lignée de cellules tumorales mammaires la plus utilisée dans les laboratoires de recherche sur le cancer du sein
MCF-7
1% D'ATB + antimycosique
solution ( Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA) )

DMEM sans rouge de phénol / milieu F-12
(Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA) )
10% de FBS Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA)
37 °
atmosphère humidifiée contenant 5% de CO 2
ensemencées dans 25 cm 2 flacons
et cultivées jusqu'à 40 -60% de
confluence
[25-250um] H2O2
(Sigma (St. Louis, MO ) )
Pendant 24 heures
exposition aiguë
[25-250 um ] H202
( Sigma (St. Louis, MO ). )
repiquées tout les 6 jours lorsque les cellules arrivent a 70 - 80 % de confluence
l'opération est répétée pendant 3 mois
exposition chronique
2 - mesure des espèces réactives d' oxygène
le but : c'est de confirmer que l'exposition au H2O2 induit la production de ROS
la méthode diacétate de 7 - dichlorodihydro fluorescein = DCFH-DA (Sigma (St. Louis, MO ) ) : composé stable , fluorogéne et non polaire
diffuse a l'intérieur des
cellules
pour cela les cellules :
ont été ensemencé dans 96 puits
rincer avec du PBS puis mise a incuber avec 10 Um de DCFH-DA pendant 30 minutes
rincer avec du PBS ensuite traitées avec une solution de H202 pendant 30 minutes
la fluorescene a été mesuré en utilisant
: Biotek Synergy-4 lecteur de microplaques à une longueur d'onde d'excitation de 485 nm et une émission de longueur d'onde de 535 nm
le résultat du traitement est représenté dans la figure suivante :
figure 1
: representation graphique des résultats du test DCFH-DA sur les cellules MCF - 7 traitées au H202 (P <0,05) des changements statistiquement significatifs sont indiqués par symbole *.
conclusion :
Le Taux de ROS intracellulaire augmente avec la dose de H202 a la quelle est exposées la cellules
se désacétyle via
des esterases intracellulaire
un composé non fluorescent
2 ', 7'-dichlorodihydrofluoresceine (DCFH)
oxydation par
les ROS
composé hautement
fluorescent le 2 ', 7'-dichlorofluorescéine (DCF)
émet une fluorescence
proportionnel aux taux
de ROS intracellulaire
3-nombre de cellules et viabilité cellulaire
but : étudier les effets de l'h202 sur la croissance cellulaire
la numérotation
cellulaire

MCF-7 dans 6 plaques
de puits
fixation et accroissement
Pdt 2 jours jusqu'a 60-70 %
de confluence
traitement avec
du H2O2
[25 a 250 um ]

exposition
aigue
après 24h
les cellules sont trypsinisée
mise en suspension dans des milieux de cultures
numérotation
cellulaire via
un compteur
de cellules automatique
Cellometer T4
(Nexcelom Biosciences)
exposition
chronique
MCF-7 traité
au H202 pdt
3 mois ont été
utilisé pour
l' ensemencement

dosage de la
viabilité cellulaire
3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -2,5-diphényltétrazolium
bromure méthode = MTT ( Sigma (St. Louis, MO ) )
de réduction du colorant
=
déterminer la cytotoxicité de h202
L'intensité de la couleur résultant a été mesurée à 570 et 630 nm en utilisant l'absorbance Biotek Synergy-4 lecteur de microplaques
les résultats de ces deux expériences sont représentes au niveaux des figures 2A et 2B .
Figure 2
représentation graphique de données
de l'analyse de la numération cellulaire (figure 2A) et du dosage MTT (figure 2B) des cellules MCF-7 après exposition chronique et aigue au H202

Conclusions
l'expostion aigue
augmentation
de la cytotoxicité
Des MCF-7
diminution
de la viabilité
des MCF-7
diminution de
la croissance
cellulaire
des MCF
l'exposition
chronique
adaptabilité
acrue des MCF-7
au H2O2
augmentation
de la croissance
cellulaire
augmentation
de la viabilité
cellulaire
4- analyse du cycle cellulaire
but
: d'étudier le effet de l'exposition chronique et aigue aux peroxyde d'hydrogéne sur le cycle cellulaire
les cellules
MCF-7 ensemencé
dans des flacons
de 25 cm ²
exposition
aigue au H202
[ 25 a 250 um ]
pdt 24h
non traité
= Témoins

figure 3 :
histogramme représentant les résultats de l'analyse par cytométrie de flux des cellules MCF-7 qui ont subit un traitement aigue( 3A) et chronique (3B) aux H202
conclusion :
L'analyse du cycle cellulaire a confirmé les résultats précédent :
l'exposition aigue au H202
diminution de
la croissance
cellulaire
l'exposition chronique au h2O2
augmentation de
la croissance
cellulaire
adaptation
des cellules MCF-7
au stress oxydatif
causés par les ROS
qui sont induites par
le H2O2
5- Extraction de l'ARN et quantitative PCR en temps réel (RT-PCR q)


but
:
la compréhension des bases moléculaires de la toxicité induite par l'exposition aigue ainsi que l'adaptation accrue des cellules MCF-7 suite a l'exposition chronique aux H2O2
l'étude de l'effet de l'exposition chronique / aigue aux H2O2 sur le potentiel métastasique des MCF-7
McF-7 /
exposition aigue
Mcf-7
témoins
MCF-7
exposition chronique
isoler les ARN-TOTAUX
quantification par Nanodrop
10000 spectrophotometre
( thermo- scientific )
amplification
qRT-PCR dans
Icycler- Q
(Bio- RAD)
gènes de
la croissance
et de la survie
cellulaire
cycline D
survivin
la poly ( ADP-Ribose)
Polymerase 1 (PRAP1)
Bcl 2
gènes marqueurs
de métastse
CD44
CD 41
WNT1
VEGF
les résultats de l'étude de l'expression des gènes
de croissance et de la survie cellulaires sont représentes dans les figures 4A et 4B
les résultats de l'étude de l'expression des gènes
marqueurs de la métastase sont représentes dans les figures 5A et 5B
figure 4
: représentation graphique des résultats le RT-PCR en temps réel de l'expression du gène de la croissance cellulaire et la survie des gènes liés des cellules MCF-7 aprés un exposition aigue ( 5A) et une exposition chronique ( 5B)
figure 5
: représentation graphique des résultats de la RT-PCR en temps réel de l'expression des gènes marqueurs de la métastase des MCF-7 après exposition aigue ( 5A) et exposition chronique ( 5B)
conclusions
L'exposition chronique
aux H202
une augmentation de
la croissance cellulaire De MCF-7
augmentation
du potentiel métastasique
des cellules MCF-7
6- dosage de la gélose molle pour formation de colonies
But
: déterminer l'effet de l'exposition chronique au stress oxydatif induit par le peroxyde d'hydrogenr sur ​​le phénotype tumorigène des cellules MCF-7
1,5ml de gélose
0,05%
milieu de DMEM
ajoutés a des plaques a 6 puits
polymériser
Couche de
base de la
Gélose
0,35 % de gélose
milieu de culture
cellulaire
refroidie a 40°
couche supérieur
de la gélose
ajout de MCF-7
ayant subis une exposition
chronique aux H2O2 [25-250 um]
solidification
et incubation
a 37 °
la formation de colonie est suivie quotidiennement par observation microscopique
comptage des colonies et prélèvement des images a 14 jours
les résultats du dosage de la gèlose molle sont représentes dans les figures 6 et 7
Figure 6
: Figure 6. photographies représentant le nombre de colonies cultivées sur gélose molle.
commentaire
:
augmentation significatif du nombre de colonie sur gélose molle cultivés a partir de cellules exposés chroniquement a [ 25-250um] de H202 / témoins
augmentation de la taille des colonies / témoins

figure7
: histogrammes montrant l'effet de l'exposition chronique aux H202 sur le nombre de colonie de colonie cultivée sur agar mou

Conclusion
L'exposition chronique des Cellules MCF-7 aux Peroxydes d'hydrogene
faible dose
forte dose
une augmentation

de la croissance
cellulaire des MCF-7
la tumérogénicité
des cellules MCF-7
I-Introduction
la chirurgie
l'hormonothérapie
la chimiothérapie
thérapie criblée
radiothérapie
le cancer du sein est une tumeur maligne qui se développe au niveau du sein
l' apparition d'une
boule qui peut s' accompagner par
des ganglions dure au niveau des aisselles
a cause de la propagation
du cancer ainsi qu'a
des modifications cutanée
au niveau du sein et du mamelon
la déformation
et l' ulcération
progressive du sein
Le diagnostic tardive
du cancer
la propagation
de la tumeur
et apparition d'autres
symptomes
Des nausées
vomissement
céphalées
=
mal de tête
perte de
poids
douleurs
osseuses
une jaunisse
Le cancer du sein représente le cancer le plus diagnostiqué chez les femmes dans le monde

Il est plus souvent diagnostiqué chez les femmes de plus de 50 ans

La principal cause de mortalité chez les femmes

Lorsqu'il est détecté a un stade précoce , son traitement est plus facile et les risques qu'ils représentent sont moins importants

Il existe differents types de traitement pour le cancer du sein tel que :



Généralité sur le cancer du sein
Parmi les Facteurs qui entraînant
L 'apparition du cancer du sein
Les oestrogènes
Hormones naturelles , sécrétées par les ovaires
assurent différents rôles :

la croissance
des organes génitaux
au niveau du sein
via des récepteurs
qui sont toujours conservés lorsque la cellule devient cancéreuse
le cancer peut se développer suite a plusieurs facteurs
sexe
age
grossesses tardive
absence de grossesses
ménopause
et
règles précoces
obésité
antécédent personnel
de
cancer du sein
exposition
aux hormones
ainsi que les
traitement hormonaux
prédisposition
familiales et génétiques tel que les mutations au niveau des Gènes BRCA1 , BRCA2
les radiations ionisantes
les oestrogènes synthétiques induisent aussi le cancer du sein
La maternité précoce , ainsi que l'activité physique régulière , allaitement et le maintiens de l'équilibre énergétique réduisent le risque de cancer

De nombreuses études ont été faites pour comprendre la biologie du cancer du sein , elles ont montré que :
l'exposition a des niveaux élevés d'oestrogenes et des produits chimiques oestrogéniques
développement et la progression du cancer du sein
Implique la présence d' un lien entre les oestrognes et les xenoestrogenes ( diéthylstilbestrol , les biphényles polychlorés )
Entraîne la prolifération des cellules cancéreuses et mammaires par divers mécanismes :
L' activation
d'oncogéne
L'activation du
signal mitogéne
L'activation de gènes
suppresseurs
de tumeurs
les oestrogenes naturels / synthétiques
augmentation La production des ROS
impliqués
L' apoptose
cellulaires
stress oxydatif
cancérogenèses
Les stress oxydatif peut être aussi induit par :
dysfonctionnement mitochondriale
l'intervention thérapeutique dans les cellules Cancéreuses
L'activité des phagocytes tels que les macrophages , les Leucocytes nucleaires morphopoly (PNM)

La plupart des travaux antérieures ont utilisé des modèles à court terme pour étudier la réponse des cellules du cancer du sein au stress oxydatif.
Cependant, les effets à long terme de exposition persistante au stress oxydatif en raison de l'augmentation ROS sur la croissance du cancer du sein, tumorigénicité et le potentiel métastatique n'est pas connue
évaluation de l'effet du peroxyde d'hydrogéne exogéne qui induit un stress oxydatif chronique /aigue
sur

la croissance
la survie
tumérogénécité
des cellules MCF-7
du cancer du sein

Cette étude confirme que l'exposition aiguë au H2O2
Effet dose
dépendant
faible
dose
survie
cellulaire
Forte
dose
cytotoxicité
=
mort cellulaire
Cette étude montre que l'exposition chronique au H2O2
augmentation
du potentiel métastasique
augmentation de l'expression
des gènes prométastasiques
diminution des
gènes anti-métastasiques
confirment
les études précédentes
VEGF = principaux facteurs
de l' angiogenése
qui va induire la prolifération
et la migration des cellules
endothéliale
La quantité de ROS
était supérieur dans les
tumeurs métastasiques par rapport
aux Cellules Normal et maligne primaire
la mutation
de L'ADN mitochondriale
entraine une augmentation
Des ROS qui induisent une
augmentation du potentiel
métastasique
ROS régulent la Diaphonie
cellulaire entre la cadhérine et
les intégrines
l'exposition chronique aux H2O2 va diminuer l'expression
D'E-cadherine ( molécules d'adhésion aux Cellules
Epitheliales )
Jouent un rôle important dans l' étape initiales de la
métastases plus précisément dans la transition épithelio-mésanchimateuses
augmentation de l'adaptabilité des cellules du cancer du sein
par sélection des cellules souches cancéreuses
ce qui est en accord avec les études précédentes
suggéraient la présence
des cellules souches cancéreuses
dans la population des cellules
du cancers du sein
L'exposition des cellules
cancéreuses génétiquement instable
aux micro environnement sélective
de la tumeur ( augmentation des ROS )
expliquer la Formation
des cellules souches du cancer
l'élévation de l'expression
des gènes CD44
diminution de l'expression de La
E-cadhérine Dans les cellules
souches du cancer
considérées comme
responsable de la métastase
RMQ
: Une étude plus approfondie est nécessaire pour comprendre comment ces cellules souches du cancer tolèrent la toxicité induite par ROS et d'identifier les changements épigénétiques, qui leur donne l'avantage à tolérer ROS.
la survie
la tumorigénicité
des cellules MCF-7
peuvent expliquer
la résistance acquise aux
médicament chimiothérapeutique
suite a un traitement trop
Long
certains agents
thérapeutique induisent
un stress oxydatif au niveau
des cellules cancereuses
exposition chronique
au H202 [ 25 a 250 um]
pdt 3 mois
recueillie
fixer a l' éthanol a 70%
pdt 24h a 4°
centrifugation
lavées avec PBS
refroidie a la glace
coloration avec
Guava réactif du cycle cellulaire (Millipore)
analyse du cycle cellulaire
par
cytomètrie de flux
les résultats de l'analyse sont représentés
dans les figures 3A 3B
Les deux cultures en traitement aigu et chronique ont été maintenues et traitées en triple exemplaire. Cultures parallèles ont été cultivées et entretenues comme un passage témoins appariés
PLAN :
I- Introduction
II- Objectif
III-Matériels et méthodes et résultats
IV-discussion
V-Conclusion
université des sciences et de la technologie houari boumediene
facultés des sciences biologiques
département de physiologie et biologie des organismes
Mastre1 : physiopathologie cellulaire et moléculaire
Chronic Oxidative Stress Increases Growth and Tumorigenic Potential of MCF-7 Breast Cancer Cells

Prathap Kumar S. Mahalingaiah, Kamaleshwar P. Singh
Published: January 28, 2014DOI: 10.1371 journal.pone.0087371
Réaliser par :
Berkan Massilia
Khiat Nihad
Regouat Kenza

test statistique utilisé : test Anova
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