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Fluorocitometria

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by

Gabriela Aviles

on 14 April 2016

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Transcript of Fluorocitometria

FACS
U.M.S.N.H
Fac. Quimicofarmacobiología
Inmunología II
FLUOROCITOMETRIA DE FLUJO
Profesora:
M.C. Maria Rebeca Tinoco M.
Integrantes del equipo:
Humberto Mora Ruiz
Gabriela Zamora Aviles
Antecedentes
El primer dispositivo de citometría de flujo basado en fluorescencia fue desarrollado en 1968 por Wolfgang Göhde de la Universidad de Münster.

El nombre original de la citometría de flujo era "citofotometría de pulso" (en Alemán: Impulszytophotometrie)

Citometría de flujo
Cito:
célula
metría:
medición
flujo:
fluido
En la citometría de flujo, las células o las partículas en suspensión, rodeadas por un liquido envolvente, se hacen pasar alineadas y de una en una por delante de un haz luminoso.
Existe interacción entre las mismas con el rayo de luz generando señales.
Estas señales proporcionan datos que se representan por histogramas.
Una de las características analíticas más importantes de los citómetros de flujo es su capacidad de medir múltiples parámetros celulares, como el tamaño, forma y complejidad y cualquier componente celular o función que pueda ser marcada con un fluorocromo.

Fundamento
Es una técnica de análisis celular multiparametrico  cuyo fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas  (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado.

Tiene la capacidad de detectar simultáneamente la fluorescencia de dos, tres, cuatro o actualmente hasta 13 fluorocromos de diferentes longitudes de onda.



L
a citometría de flujo permite medir diferentes parámetros de una célula.
Controles neumático y fluidos para establecer un flujo laminar que permita a la suspensión celular atravesar la cámara de flujo.
SISTEMA HIDRAULICO
Fundamento del equipo
SISTEMA OPTICO
Láser (Argón con luz monocromática de 488nm , filtros , lentes y detectores.

SISTEMA ELECTRO INFORMATICO
Convierte la luz dispersa en señales eléctricas y las procesa para su análisis.


Tamaño relativo
Complejidad interna relativa
Intensidad de fluorescencia relativa

Parámetros que mide un citómetro de flujo:
Componentes de un citómetro de flujo
Los principales componentes de un citómetro de flujo son
:
Sistema para inyectar la muestra.
Cámara de flujo.
Fuente de luz.
Sistema óptico.
Detectores.
Amplificador/convertidor.
Sistema informático.

Sistema para inyectar la muestra
Utilizan dos tipos de sistemas para introducir la muestra en la boquilla o cámara de flujo: de presión diferencial y volumétrico.

El mas habitual es el de presión diferencial.
El vial que contiene la muestra se mantiene a una presión mayor que la del contenedor del liquido envolvente. La velocidad del flujo es determinada por la presión y por la resistencia del tubo.

Esta compuesto por dos compartimentos : el del líquido que contiene la suspensión celular y el del líquido envolvente.
Empujados por un sistema de presión, los líquidos entran en contacto en la cámara de flujo.
Esta cámara es el centro del citómetro, ya que en ella se genera el flujo laminar de células que luego atraviesan el rayo luminoso.

Cámara de flujo
Fuente de luz
La fuente de luz es un rayo láser. Este suele ser de argón de 488nm enfriado por aire y tener una potencia de emisión de 15mW, aunque también puede ser de helio-neón de 633nm o de kriptón de 657nm.

Sistema óptico
Poseen cinco sistemas ópticos de medida:
Dos de dispersión de luz, uno hacia adelante y otro en ángulo recto, y tres de fluorescencia.
Hacia adelante: determina tamaño de células.
En ángulo recto: determina granulosidad.
Fluorescencia: Se sitúan en ángulo recto y con ellos se determinan las células marcadas con los compuestos fluorescentes.

Detectores
Se utilizan tres tipos de detectores:
Fotodiodos.
Fotomultiplicadores.
Detectores monocromáticos.

Amplificador/convertidor
Cada detector genera una señal electrónica que es proporcional a la cantidad de luz dispersada o a la intensidad de la fluorescencia. Esta señal se amplifica multiplicándola por un factor lineal o logarítmico.
El pulso amplificado se lleva a un convertidor analógico/digital que convierte la altura del pico, a la fuerza de la señal.

Sistema informático
Se deben usar programas de ordenador adecuados que permite hacer un análisis multidimensional sensible y objetivo en cada célula.

Muestra
Los especímenes que se analizan son suspensiones mono dispersas, que debe procurarse que no tengan apelotonamiento ni restos.

Las muestras que pueden ser utilizadas son:

Células
Cromosomas
Bacterias
Partículas

Todas las muestras destinadas a citometría de flujo deben estar en suspensión liquida, por lo que las células provenientes de tejidos solidos deben ser desagregadas antes del análisis:

Hígado
Timo
Páncreas
Pulmón
Tiroides
Intestino

Cuando se estudien las células nucleadas los eritrocitos se lisan empleando agua destilada, una solución de cloruro amónico o un detergente débil.
Todos los especímenes sanguíneos, con independencia de anticoagulante, deben mantenerse a temperatura ambiente.

En las muestras de sangre
Técnicas para disgregar tumores:

Enzimática:
Producen suspensiones celulares.

Técnicas con detergentes:
proporcionan núcleos.

Se pierden las interacciones célula-célula y las interacciones de la célula con la matriz extracelular.


Principales enzimas utilizadas:

Tripsina, proteasa neutra, colagenasa, hialuronidasa y la Dnasa.
Principales detergentes:
Triton X-100 y Nonidet P-40.
Tinción
La células pueden teñirse de dos maneras:

Método directo: El anticuerpo se encuentra marcado con un fluorocromo y se incuba con las células.
Método indirecto: Las células se incuban con un anticuerpo primario, se lavan y luego se incuban con un anticuerpo secundario que lleva el fluorocromo.

Flebotomía
Pasar a un tubo de citometría, 200 μl de muestra.
Marcar con anticuerpos
Utilizar anticuerpos necesarios
Incubar 30 minutos en obscuridad a 4°C
Lisis de eritrocitos
Adicionar 500μl de solución de lisis y agitar vigorosamente

2 lavados con solución salina isotónica

Centrifugar

Desechar sobrenadante
Resuspender el residuo en solución para ser leída en el citómetro
Introducir en el citómetro
Tecnica
Que es un fluorocromo?
Fluorocromo es una molécula que fluorese o emite luz cuando es excitada por una fuente de luz, como el haz de láser, el fluorocromo absorbe energía de una determinada longitud de onda y emite energía de menor longitud de onda
Cada fluorocromo tiene sus espectros característicos y excitación y emisión.
La emisión es separada por el filtro y enviada al detector correspondiente.
Para identificar un determinado antígeno en la superficie de una célula, se conjuga un fluorocromo a un anticuerpo.
Interpretación de datos
Recolección y visualización de datos
La fluorescencia emitida por lo fluorocromos es recogida por diferentes receptores tras ser filtrada por diferentes cristales dicroicos
Receptores transforman la luz en señales eléctricas
El aparato de FACS va acompañado por una computadora que adquiere los datos proporcionados por el sistema eléctrico y hace una presentación gráfica
Interpretación de resultados.
De cada una de las células que atraviesa el láser se guardan una serie de parámetros:
los diferentes fluorocromos detectados
la complejidad de su citoplasma
el tamaño de la célula.
Dependiendo del numero de parámetros a comparar se pueden realizar diferentes tipos de representación.
Muestra un único parámetro contra el numero de eventos
Los eventos con mayor intensidad de fluorescencia, aparecen a la derecha en el eje de las x
Muestra dos parámetro simultáneamente.
Cada punto representa un evento (célula o partícula)
Los puntos aparecen mas a la derecha e el eje de las x o mas arriba
en el eje de las y a medida que la señal se incrementa
Gráfico de densidad
Muestra dos parámetro simultáneamente
Provee una tercera dimensión, utilizando el color para
el numero de eventos
Definición de gate
Gate: es un limite o contorno gráfico que se hace sobre una población de células o partículas para centrar el análisis exclusivamente en esa subpoblación.
Ejemplos:
Aplicaciones en la inmunología
diagnóstico y clasificación de las inmunodeficiencias primarias
monitoreo de enfermedades autoinmunes (esclerosis múltiple 9 , el lupus eritematoso sistémico 10 y la artritis reumatoide)
seguimiento de la recuperación inmune tras el trasplante de médula ósea
identificación precoz del rechazo en pacientes que han recibido un trasplante alogénico
Aplicaciones
Inmunofenotipificación de superficie
Antígenos intracelulares
Antígenos circulantes
Detección de autoanticuerpos circulantes
Inmunoproliferacion
Principales aplicaciones
Identificación de poblaciones celulares mediante anticuerpos monoclonales
-linaje celular
-estado de maduración hematopoyetica
-implicación en la respuesta inmune
-grado de activación celular
identificación de poblaciones celulares hematopoyeticas
-inmunodefiiencias
-deteccion de enfermedad minima residual

detección de proteínas intracelulares con anticuerpos fluorescentes

-Producción de citocinas intracelulares
análisis de citocinas intracelulares
-Fenotipo
-
Detección de aloanticuerpos circulantes
- pruebas pretrasnplantes
Detección de anticuerpos unidos a células de la sangre
Análisis del ciclo celular
-Contenido de ADN,
-fenotipo del ADN

CITOMETRÍA DE FLUJO Y VIH
El monitoreo de subpoblaciones linfocitarias en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), fundamentalmente la cuantificación en sangre periférica de las células CD4+ y los linfocitos CD8+ aporta un valor diagnóstico y pronóstico en esta patología
Cuando éste infecta humanos, las células que con más frecuencia infecta son las CD4+, que se multiplican para combatir infecciones y producir más copias del VIH. El número absoluto de linfocitos T CD4+ es el parámetro celular asociado más estrechamente a la progresión de la enfermedad causada por el VIH y al pronóstico del paciente
VENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Análisis de un número estadísticamente significativo de células ( 1000 a más de 100.000 células).
Múltiples marcajes de una sola célula.
Análisis de alto numero de partículas en corto tiempo (5.000 eventos /seg. ).
Alta sensibilidad y objetividad.
Medidas separadas de cada célula (no sólo el promedio).
Medidas cuantitativas : discriminación de las células según la cantidad de marcador.
Múltiples parámetros : define subpoblaciones complejas.
Miles de células por segundo (1).
DESVENTAJAS DE LA CITOMETRIA DE FLUJO
Poca información morfológica de la célula
No proporciona información de la localización celular en un tejido
Puede analizar solamente una cantidad limitada de material (10 millones de células / hora)
Necesita suspensión de células individuales (1).
Costos de la tecnología
Método destructivo.
Incapacidad de visualizar las células que se analizan.
Bibliografias
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/FACS.pdf
A. Sampedro; J.R. de los Toyos; A Martinez-Nistal “Técnicas de fluorescencia en microscopia y citometría”. 2010. Editorial Universidad de Oviedo, Servicio de Publicaciones. 253 paginas.
http://www3.uah.es/curso_jorge_monserrat/Clases/clase%20fundamentos2009.pdf
http://www.scielo.org.mx/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0187-75852004000100007
http://www.javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/citometria.htm
http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/met/FACS.pdf
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