Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

METAGENOMIK

No description
by

hakan burhan

on 29 April 2015

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of METAGENOMIK

Metagenomik
Metagenomik, birden fazla mikroorganizma içeren örneklerin
izole edilmeden
ve
kültür edilmesine
gerek duyulmaksızın direkt olarak doğal ortamlarından DNA’nın ekstrakt edilmesi ve sekanslama tekniği kullanılarak analiz edilmesidir.
Bu terim ilk olarak 1998 yılında Jo Handelsman tarafından kullanılmıştır.
Image by Tom Mooring
METAGENOMIC
Analiz edilecek olan DNA parçalanarak ya da 16S / 18S rDNA genleri amplifiye edilerek vektöre klonlanır. Klonlanan parçalar konak bakteri içerisinde çoğalır ve seçilen koloniler sekanslanır
Barış AGDUK
Hakan BURHAN

Metagenomik örnekleri hemen hemen her yerde bulunabilir. Insan kalın bağırsak florası, deniz suyu, çamur, toprak, madenler, aşırıya kaçan ortamlar (tuzlalar, volkanlar, jeotermal yapılar vs.) birer metagenomik örnek havuzudur
Bu örneklerden ekstarkt edilen DNA sekanslandıktan sonra metagenomik bir çalışma için en önemli aşama olan “Biyoinformatik Analiz” kısmında genel olarak ardışık iki biyoinformatik yöntem kullanılmaktadır. Bunlar, “Genom dizilerinin birleştirilmesi ve Birleştirilen dizilerin sınıflandırılması” aşamalarıdır.
Metag
enomiğin moleküler biyoloji, mikrobiyoloji, ekoloji, kimya ve biyoinformatik
gibi birçok disiplini kapsayan bir çalışma alanı olduğu bilinmektedir. Metagenomik alanı esas olarak; prokaryotik
çeşitliliğin daha önce bilinenden fazla olduğunun anlaşılmasıyla, geleneksel
kültüvasyon tekniklerinin sınırlarının belirlenmesiyle ve prokaryotik
populasyonların önemli bir biyoteknolojik kaynak olduğunun anlaşılmasıyla
gelişmeye başlamıştır.
Çevremizdeki mikroorganizmla
rın % 98’ inden fazlasının kültüre edilemediği göz önüne
alındığında, bu zorluğun üstesinden gelebilecek DNA tabanlı teknolojilerden birinin metagenomik olduğu görülmektedir. Teorik olarak metagenomik kütüphaneler DNA ekstraksyonu ve klonlama metodlarına bağlı olarak, tek bir habitatın tüm genetik komplementlerini temsil etmektedir. Bir metagenomik kütüphanede saklı olan bu bilgiler; topluluk çeşitliliğinin, spesifik bir mikroorganizma varlığının veya biyosentezsel yol izi genleri gibi genlerin aranmasında kullanılmaktadır.
Metagenomik Çalışmaların Tarihsel Gelişimi
1998 yılında Jo Handelsman ve arkadaşlarının “
Shotgun metagenomik metodlar” adını verdiği araştırmalardan, doksanlı yılların ortalarından günümüze kadar yaklaşık olarak 45 temel çalışma yapılmıştır. Bu çalışmaların çoğu deniz
mikrobiyal shotgun metagenomiği ile ilgilidir.
Metagenomikle ilgili yapılan çalışmalar tarihsel olarak ve kategorilere ayrılarak incelendiğinde şu şekilde sıralanabilmektedir.
Fosmid, kosmid ve BAC (yapay bakteri kromozomu) türevli metagenomik çalışmalar
Sanger dizileme türevli shotgun metagenomik çalışmalar
Yeni nesil dizileme türevli shotgun metagenomik çalışmalar
Rondon ve arkadaşları ilk kez
Escherichia coli
’ deki BAC insert DNA’sını gram pozitif bir bakteri olan
Bacillus cereus
’ ta çalışmış ve çevresel DNA çalışmalarının önünü açmışlardır.
Beja ve arkadaşları ilk kez, deniz mikrobiyal metagenomik DNA’ sından BAC klon kütüphaneleri oluşturmuşlar ve deniz Archaea’ ları hakkında önemli bilgiler sağlamışlardır.
Grzymski ve arkadaşları Antartika kıyı sularından fosmid kütüphanesi oluşturmuşlar ve son derece ekstrem soğuklarda yaşamaya adaptasyon sağlamış bir protein keşfetmişlerdir. Ayrıca gen clusterları’nın tanımlanmasıyla horizontal gen transferleri ortaya çıkarılmıştır.
Günümüzdeki önemli çalışmalardan biride, Delong ve arkadaşlarının Pasifikteki “Hawaii Okyanus Zaman Serileri” (HOT) istasyonundan örnekler alarak yaptığı bir fosmid çalışmasıdır. 64 milyon baz çifti gibi çok fazla miktarda DNA dizisi elde edilmiştir. Elde edilen verilerin analizi ile yakın protein cluster’ larının spesifik derinliklerde bulundukları ve tür zonasyonunun kara habitatlarına benzer olduğu gösterilmiştir.
Bu
metagenomik çalışmaların sonu gelmeyen yararlarından biride diğer çalışmalarla karşılaştırmalar yapmak ve gen profillerinin belirlenmesi için metagenomdaki çevresel karakteristiklerin yayınlanmasıdır.
2004 yılında küçük insert klonların etkili dizilenmesini sağlayan Sanger dizi teknolojisinin daha iyi yapılandırıldığı görülmüştür. Venter ve arkadaşları bu teknolojiyi Sargasso Denizindeki “Bermuda Atlantik Zaman Serileri” çalışma sitesindeki okyanus mikrobiyal topluluklarının karakterizasyonunda kullanmıştır. Bu çalışmada bir milyar baz çifti dizi verisi işlenmiş ve bu verilerin işlenmesi için gerekli yeni biyoinformatik uygulamalar geliştirilmiştir. Çalışmada 1,800 eşsiz genom, 48 yeni bakteriyel filotip ve daha önce tanımlanmamış 1,2 milyon gen rapor edilmiştir.
Çığır açan bu çalışmada tek bir genom için yaygın olarak kullanılan
dizileme yönteminin, bireysel bir genomun ötesinde ilk kez kullanıldığı görülmektedir. Kabaca deniz suyunun 1 mililitresinde yaklaşık 1 milyon bakteri olduğunu ve ortalama genom büyüklüğünün tahmini 2 milyon baz çifti olduğunu düşünürsek Sargasso Denizi projesi ile ancak okyanusta bulunan tek bir damlanın yalnızca % 0,05’ inin dizi verisinin elde edilebildiği görülmektedir.
Daha sonraki çalışmalarda aynı araştırma grubu, “Global Okyanus Örnekleme” (GOS) seyahatlerine çıkarak kuzeybatı Atlantik ve tropikal doğu Pasifik’ten benzer teknolojileri kullanarak 7,7 milyon dizi okumasından toplam 6,3 milyon baz çifti dizi verisi elde etmişlerdir
Metagenomik Metodolojiler
Çevresel örneklerden DNA izolasyonu
Metagenomik kütüphaneler oluşturmak ve verimli moleküler analizlerde kullanmak için denizel kaynaklardan ve topraktan birçok DNA izolasyon metodu ge
liştirilmiştir.
Dondurarak öğütme,
Boncukla homojenizasyon,
Ultrasonikasyon
SDS içeren kimyasal parçalama protokolleri
Genomun Metabolik Olarak Aktif Hücrelerce Zenginleştirilmesi
Günümüzün teknolojisi ile toprak mikrobiyal topluluklarındaki tüm genomların içeriğini saptamak oldukça zordur. Bu yüzden mikrobiyal t
oplulukların bilinen özelliklerinden yola çıkılarak karmaşık yapı aydınlatılmaya çalışılmaktadır.
ilk başta GC içeriği ile DNA’ nın elde edilmesi için ultrasantrifüj basamağı
Bromdeoksiüridin (BrdU) zenginleştirme yöntemi (metabolik olarak aktif organizmanın DNA’ sına etiketli bir nükleotid eklenmesi ve bu etikete bağlı olarak DNA’nın izole edilmesi)
Kararlı izotop problama (SIP) (DNA veya RNA’ nın etiketlenmesi ve ayrımında başarılı)
Bu uygulamalar bir mikrobiyal toplulukta istenilen özelliklere sahip kesimin DNA’ sını içeren metagenomik kütüphanelerin sayısını arttırmaktadır.
Metagenomik Klonları Zenginleştirme Stratejileri
Mikrobiy
al toplulukların biyodegredatif kapasiteleri veya ürettikleri özel metabolitler, gene özel PCR metodlarıyla kapsamlı olarak taranmaktadır.
Tail PCR, panhandle PCR, casette PCR, adaptor ligation PCR ve pre-amplification inverse PCR
Bu metodların yorucu ve zaman alıcı olmasına rağmen ham petrolü ve fenolü parçalayan bakteri topluluklarında görülen katekol 2,3-dioksijenaz ve 2,5 diketo-D-glukonik asit redüktaz gibi yeni gen varyantlarının elde edilmesinde başarıyla kullanıldığı görülmektedir.
Bakteriyel genlerin keşfi için bir başka alternatif Differential Display (DD) tekniğidir. (Rastgele primerler kullanılarak yapılan ters transkripsyon PCR (RTPCR) ile istenilen özelliklere sahip bir organizma, filogenetik grup yada metabolik yol izi hedeflenerek çevresel örnekten mikrobiyal transkriptlerin geri kazanılıp analiz edildiği gösterilmiştir)

Bazı metagenomik kütüphane çalışmaları özel klonların aktiviteleri üzerine odaklanmıştır. Bu araştırmaların gelişimi için kilit yöntem istenilen bir
işlevi, birlikte yerine getiren klon konsorsiyumunun zenginleştirilmesidir. Bu uygulayamaya, topraktaki poliklorinat bifenil (PCB) bileşiğinin parçalanmasında görevli, mozaik bir yol izinin parçaları olan iki yada daha fazla bakteri türünün bir araya getirdiği “PCB parçalama kompleksi gen havuzu” örnek olarak verilebilmektedir.
Atasal DNA
Yeni nesil dizileme
sistemleri ile fosilden, saç, kemik gibi donmuş veya korunmuş örneklerden elde edilen DNA'ların geniş kapsamlı analizini yapmak mümkündür. Yapılan bir çalışmada yeni nesil dizileme ile 38000 yaşında Neanderthal fosilinden elde edilen atasal DNA dizilenerek günümüz insan ve şempanze DNA'ları ile karşılaştırılmış ve Neanderthal DNA dizisinin modern insan DNA dizilerinden 500 000 yıl kadar önce birbirinden ayrıldığı tespit edilmiş
Transkriptom
Transkriptom dizilem
e, mRNAtranskripsiyon-ekspresyon analizi, yeni genlerin keşfi, henüz genomu tamamıyla tanımlanmamış organizmalarda gen bölgelerinin tanımlanması, tüm gen dizisinin oluşturulması, tek nükleotid polimorfizmlerin (SNP) belirlenmesi, insersiyon-delesyonlar ve splicing varyantların tespiti, allel spesifik ekspresyonların analizi ve kromozomal yeni düzenlenmelerin belirlenmesini k
apsar.
Küçük RNA'lar (Small RNA'lar)
Küçük RNA'lar; MicroRNA'lar, endojen siRNA'lar ve Piwi-interacting RNA'ların dahil olduğu grupt
ur. Bu sistem sayesinde bakteri içerisinde klonlanma yapılmadan, yüzlerce hatta binlercesi tanımlanabilir ve miktarı belirlenebilir. Daha önce tanımlanmamış küçük RNA'lar tespit edilebilir ve farklı ekspresyon profili çıkartılabilir veya küçük RNA transkriptomları ile karşılaştınlabilir
Metilasyon Analizi
Son yıllarda yapılan çalışmala
r, DNA metilasyonundaki değişikliklerin kanser, nörolojik hastalıklar (Şizofreni, Alzheimer) ve kardiyovasküler hastalıklar (Ateroskleroz, Homosisteinemi) ile ilişki olduğunu göstermiştir. Genom boyu metilasyon kaybı ya da bazı genlerin promotor bölgelerindeki CpG adacıklarının hipermetilasyonu, bu hastalıklann gelişiminde son derece önemlidir. Kanserlerin ailevi formlarıyla ilişkili genlerin yaklaşık % 50'sinde promotor hipermetilasyonu görülmüştür. Bu sistem ile hedef genomik dizideki metilasyon belirlenebilir.
Metagenomik yaklaşımlar ekonomik değeri olan alanlarda daha sık kullanılmakla birlikte canlılarda kaynağı bilinmeyen enfeksiyonları tanımlamak içinde kullanılır.
Bitkiler ve Tarımsal Biyoteknoloji
A.B.D.'de milyo
nlarca bal arısının toplu ölümüyle arıcılık sektörünü tehdit eden sorunun kaynağında IAPV adlı bir virüsün olduğunun Cox-Foster ve arkadaşları tarafından 2007 yılında ortaya konulması gösterilebilir. Shotgun dizileme tekniklerinin gelişmesiyle insanlarla bakteriler arasındaki ilişkilerin açığa çıkarılmasında da Metagenomik yaklaşım daha sık kullanılmaya başlanmıştır. Turnbaugh ve arkadaşlarının yaptığı obezite ile mide florasındaki bakteriler arasındaki ilişkiyi ortaya koyan çalışma bunların ilkidir. Insan sağlığı ve tıp alanlarında, hastane enfeksiyonları ve ağız ve diş sağlığı metagenomik yaklaşım için uygun alanlar olarak gelecek vaat etmektedir.
Soya fasulyelerind
e büyük zarara yol açan
Heterodera glycines
(Soya fasulyesi kist nematodu) 400 milyon bazlık genomu Sanger dizileme yöntemi ve mikro-bead yöntemi ile dizilenerek her iki yöntem karşılaştırılmıştır. Nematodun genomundaki SNP'lerin nematodun virulansı ve konak seçimini etkilediği bilinmektedir. Bu nedenle SNP'lerinin tanımlanması tarımsal mücadelede önemlidir.
Yeni Nesil Dizileme Teknolojisinin Kullanım Alanlarından Bazıları
Full transcript