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PCR APLICADO AL DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

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by

rocko lopez

on 26 May 2011

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Transcript of PCR APLICADO AL DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO

PCR APLICADO AL
DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO Se emplea actualmente ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a esas temperaturas. El mas utilizado es el Thermus aquaticus (polimerasa Taq). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR se desarrolla en un ciclo de tres pasos. Desnaturalización
Hibridación
Extención Desnaturalización del ADN Hibridación Esto consiste en la separación de las dos cadenas que forman la molécula de ADN que se quiere amplificar, para lo cual se debe calentar el ADN a altas temperaturas. Los puentes de hidrógeno estables entre las cadenas de ADN (unión ADN-ADN) sólo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el híbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Extensión Durante esta etapa la ADN polimerasa termorresistente sintetiza la cadena complementaria y parte del cebador como soporte inicial necesario para la síntesis de nuevo ADN. La Taq polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde añadiendo los nucleótidos complementarios en dirección 5'→ 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los nucleótidos con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente PCR in situ Consiste en una reacción de PCR realizada en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Se realiza sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. PCR en parasitología La sensibilidad de la PCR supera ampliamente a la de las técnicas convencionales directas que poseen baja sensibilidad en pacientes que padecen una infección crónica en la cual el número de parásitos circulantes es muy reducido para detectarlo por técnicas parasicológicas Estos pasos se llevan a cabo en un equipo llamado termociclador. Este equipo realiza los ciclos en los tiempos y la temperatura programados de forma exacta.
El resultado se observa en geles de agarosa o poliacrilamida y la presencia de una banda del tamaño esperado se interpreta como una reacción positiva. Utilidad de la PCR La PCR se utiliza en: -Enfermedad de Chagas Trypanosoma cruzi -Amebiasis intestinal Entamoeba histolytica. Utilidad de la PCR -Giardiasis (Giardia lamblia), identificación de la enfermedad.

-Cyclosposis, identificación de Cyclospora cayetenensis.

-Leishmaniasis, identificación de Leishmania spp

-Fasciolosis, identificación de Fasciola hepática

-Oncocercosis, identificación de Onchocerca volvulus

-Esquistosomosis,identificación de Strongyloides stercoralis

-Toxoplasmosis (Toxoplasma gondii), identificación de la enfermedad Técnica Extracción de ADN: Almacenar las muestras fecales a -80 ° C sin conservantes. 

Opcionalmente, las muestras pueden ser preservadas en dicromato de potasio y almacenadas a 4 ° C.

Centrifugar 300 ul a 500 ul de muestra a 3.000 rpm durante 5 min.

Luego agregar solventes orgánicos (fenol: cloroformo: alcohol isoamílico)

Recuperar la fase acuosa por centrifugación a 11000 rpm durante 10 min. y agregar 2 volúmenes de etanol absoluto en presencia de acetato de sodio 0,3 M a pH 5,2.

Volver a centrifugar a 11000 rpm durante 30 min. y lavar con etanol 70%. dejar secar a temperatura ambiente y resuspender en 30 µl de buffer TE (Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM).

Almacenar a –20 ºC para su posterior análisis. Materiales para la PCR Para realizar nuestra técnica de PCR necesitaremos los siguientes materiales:

Primers o Cebadores:
-Oligonucleótidos complementarios a una de las dos hebras del ADN
-Secuencias cortas de entre 6 y 40 nucleótidos, normalmente de 18 a 22. Permiten que la polimerasa inicie la reacción.
-Deben estar situados enfrentados y a no mucha distancia.
-Delimitan la zona de ADN a amplificar

Iones divalentes:
-Se suele usar magnesio (Mg2+)
-Actúan como cofactores de la polimerasa.

Solución tampón (buffer):
-Mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. Los 4 Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs):
-Sustratos para polimerizar nuevo ADN.

ADN polimerasa:
-O mezcla de distintas polimerasas con temperatura óptima alrededor de ---70 °C (la más común es la polimerasa Taq).

ADN molde
-Contiene la región de ADN que se va a amplificar.

Termociclador:
-Aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo. Técnica PCR Ingresar los tubos en el termociclador.


El proceso se realiza en tres etapas que constituyen un ciclo, que se repite un número determinado de veces.

Determinantes:
-El tiempo.
-La temperatura.
-Número de ciclos. Desnaturalización:

-Temperaturas de 94ºC durante 30 segundos a 1 minuto

-Si existe alto contenido de G + C puede aumentar el tiempo o la temperatura.

-La actividad de la enzima decrece de manera muy rápida a partir de los 95ºC. Hibridación
-La temperatura y el tiempo dependen de 3 factores relacionados con los oligonucleótidos:
-La composición de bases.
-El tamaño.
-La concentración.

-En la práctica, la temperatura puede oscilar entre 45ºC y 65ºC, durante 30 segundos hasta 1 minuto.

-Aumento de temperatura o del tiempo:
-Mayor especificidad
-Disminuye las uniones incorrectas de los iniciadores con la hebra molde. Elongación

-Generalmente se realiza a 72ºC.
-Teóricamente varia entre 70-72ºC.

-El tiempo depende de:
-El tamaño de la amplificación.
-Se puede estimar un tiempo de 1 minuto para elongar 1 Kb
-Al final de todos los ciclos se realiza una última elongación de 5 minutos a 72ºC.

-Número de ciclos
Depende de la cantidad de ADN que existe en la muestra.
Es importante no realizar un número alto de ciclos. Contaminación en la PCR Técnica muy sensible, muy importante evitar contaminación.

Posible que el ADN no deseado se amplifique y obtengamos un resultado que no es real.

Normas que ayudan a evitar las contaminaciones.  
      -Lugar físico exclusivo para realizar la PCR
        -Uso de instrumental exclusivo para la PCR
        -Utilización de reactivos y tubos estériles
        -Uso de guantes por el manipulador
        -Realización de controles de blanco (se añade agua en lugar de ADN, no debe existir amplificación). Se requiere fijar o preparar los tejidos.
Permeabilizar las membranas celulares de manera enzimática.
Los tejidos que están embebidos en parafina: Primero se deben tratar para retirar la parafina
Los tejidos frescos se fijan con formalina al 10%.
La reacción de amplificación se lleva a cabo según la técnica normal de PCR. Ventajas de la PCR: Detecta pequeñas cantidades de un microorganismo con alta especificidad y sensibilidad.

Provee resultados certeros en un corto periodo de tiempo.

Puede detectar parásitos vivos y muertos.

Detección directa del parasito.

Todas las secuencias de ADN están presentes en todas las etapas del ciclo de la vida del parasito.

Todos los organismos contienen secuencias de ADN que pueden ser empleadas para diferenciar individuos, especies o géneros.

A diferencia de los métodos inmunológicos, estos métodos son independientes de la inmunocompetencia del individuo o de la historia de infecciones previas. Desventajas de la PCR: Alto costo de implementación.

Falsos negativos por inhibidores de PCR

Falsos positivos por contaminación

Se necesitan personas adiestradas para realizar la técnica Interpretación La idea es analizar el o los fragmentos obtenidos en la PCR.

La electroforesis, ya sea en geles de agarosa o de acrilamida es la tecnica mas utilizada.  

Permite separar estos fragmentos de acuerdo al tamaño de cada uno.

De esta manera los fragmentos de tamaños similares migrarán a el mismo lugar, formando grandes bandas.

Cuando se observa una banda en el gel esperada, se considera una reacción positiva de PCR. Carriles 1 - 4: ​​ -Amplificación con un par de cebadores de PCR específica para E. histolytica.
-Diagnóstico tamaño de la banda - 876 pb.

Carriles 6-9: -Amplificación con un par de cebadores de PCR específica para E. dispar
-Diagnóstico tamaño de la banda - 876 pb. FIN Polimerasa Taq
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