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Glucosa 6 Fosfato Deshidrogenasa

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DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE GLUCOSA-6-FOSFATO DESHIDROGENASA Lina Manchola
Dario R Shaw
Objetivos -Determinar la actividad enzimática de la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa

-Analizar el efecto de diferentes factores que modifican la actividad enzimática como Temperatura, pH

-Estudiar el papel de la Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa a nivel bioquímico en el suministro de NADPH intracelular
Fundamento teórico Las enzimas o catalizadores de los sistemas biológicos, son moléculas de gran interés que determinan las transformaciones químicas presentes en la naturaleza. 1- Son los catalizadores más eficientes hasta ahora conocidos

2- presentan una especificidad de acción respecto a la naturaleza del sustrato que utiliza y al tipo de reacción que cataliza

3- No tienen efecto en la termodinámica de la reacción Glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) Es la primera enzima de la vía pentosa fosfato y la principal fuente intracelular de nicotidamina adenina dinucleótido fosfato reducido (NADPH) Importancia del NADPH Compuesto comprometido en diversos procesos fisiológicos, por ejemplo defensa antioxidante (sobre todo células como los eritrocitos), modulación del crecimiento endotelial, eritropoyesis, vascularización y fagocitosis Importancia de G6PD La importancia de la G6PD radica en la trascendencia de los procesos celulares en los que participa, tales como Génesis de NADPH. El NADPH participa en la biosíntesis reductora del colesterol y de los ácidos grasos, así como también en la síntesis del óxido nítrico (NO), La deficiencia de G6PD La deficiencia de G6PD es la enzimopatía ligada al cromosoma X más común en el ser humano.
Si bien se puede presentar en cualquier tipo de célula, su carencia absoluta es incompatible con la vida
En el mundo hay más de 400 millones de personas afectadas por la deficiencia de la enzima
La enfermedad se hereda ligada al cromosoma X y desde el punto de vista metabólico

la G6PD interviene en la etapa inicial del ciclo de las pentosas

Catalizando la oxidación de la glucosa-6-fosfato a 6-fosfoglucolato, generando además NADPH, este último permite la reducción del glutatión indispensable para eliminar el peróxido de hidrogeno que es un compuesto tóxico para el glóbulo rojo La deficiencia de G6PD Debido a la importancia de esta enzima en los procesos metabólicos del organismo es necesario realizar un estudio de su actividad. Materiales y Métodos Debido a la gran cantidad de reactivos necesarios, estos son suministrados por el Centro de Investigaciones En Bioquímica (CIBI) de la Universidad de los Andes Usando como substrato glucosa-6-fosfato y NADP, la enzima glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, cataliza la formación de 6-fosfogluconato y NADPH. La rata de formación de NADPH es detectada por el incremento en la absorbancia a 340 nm Se realizan 2 ensayos: uno en presencia de glucosa 6 fosfato y otro en su ausencia. La diferencia entre las 2 lecturas es la actividad neta de la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa PREPARACION DE MUESTRAS Y REACTIVOS •Sangre total 5 ml en un tubo de ensayo que contenga 0.5 ml de EDTA, 0.05 M, la muestra es estable hasta por una semana en refrigeración. Centrifugar a 1500rpm, durante 10 minutos. Obtener el paquete de eritrocitos, descartar el plasma completamente Reactivo parcial •REACTIVO PARCIAL (RP): Es una mezcla de reacción para la medición exclusiva de la enzima fosfogluconato deshidrogenasa, su preparación es dada por:

En matraz volumétrico aforado de 100 ml colocar:
1820gde TRIS (hidroximetilaminometano)
0.304g de Cloruro de Magnesio Hexahidratado
0.023gde NADP (Sigma No. N-3886)
0.031gde Acido-6-fosfogluconato.( Merck art. 24650)
Reactivo total Es una mezcla de reacción combinada para la medición de la G-6-PD y la fosfogluconato deshidrogenasa.

-Pesar 0.01808 g de glucosa-6-fosfato y disolverlos en 50 ml exactos de reactivo parcial MEDICION DE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA •A 200 ul del paquete globular agregar 1000 ul de solución salina (En bala Ependoff), mezclar suavemente y llevar a centrifugación durante1 minuto, descartar el sobrenadante.

•Resuspender 200 uL del paquete celular lavado con 200 uL de Cloruro de Sodio 0.85%

•Ajustar el espectrofotómetro en una longitud de onda de 340 nm y a una temperatura de 30ºC.
Preparacion... A los 10 minutos exactos empezar a leer el cambio de absorbancia de la celda T y a los treinta segundos la celda P, así cada 30 segundos el correspondiente hasta completar 7 lecturas de cada uno Calculos Resultados Resultados Análisis El rango normal de la actividad de la Glucose 6 fosfato deshidorgenasa se encuentra de 75 -215 U/1012 Eritrocitos, como se puede observar en los datos obtenidos de las diferentes muestras de personas, se encuentran dentro del rango normal de actividad enzimática Gracias!!!!!!!!
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