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BLOQUE 1. La punción por Aspiración por Aguja Fina (PAAF)

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by

Ignacio Baselga Carretero

on 26 September 2014

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Transcript of BLOQUE 1. La punción por Aspiración por Aguja Fina (PAAF)

BLOQUE 1.
Punción por Aspiración con Aguja Fina (PAAF)
UNIDADES

Unidad 1. Citología e histología general


Unidad 2. Técnicas para análisis citológicos


Unidad 3. La técnica de punción por aspiración por aguja fina

UNIDAD 1.
CITOLOGÍA E HISTOLOGÍA

ÍNDICE
1. Definición de conceptos
2. La célula
3. Membrana celular
4. Citoplasma
5. Ribosomas
6. Retículo endoplasmático
7. El complejo de Golgi
8. Transporte de membrana
9. Mitocondria
10. Microtúbulos
11. Filamentos de actina
12. Orgánulos fibrilares
13. El núcleo
14. Replicación celular
15. Diferenciación celular
16. Muerte celular



CITOLOGÍA
Parte de la biología que estudia la célula.
RAE
HISTOLOGÍA
Parte de la anatomía que trata del estudio de los tejidos orgánicos.
RAE
1. Definición de conceptos
2. La célula
Teoría del origen de las células
Formación de la tierra y de su atmósfera
Síntesis prebiótica
Formación de polímeros
Formación de protobiontes
Aparición de la primera célula
Procariontes
Membrana plasmática
Pared celular rígida
Protoplasma
Ribosomas
Apéndices
Mecanismo de división
3. Membrana plasmática
BICAPA LIPÍDICA
Fosfolípidos
Fofatidilcolina
Fosfatidilserina
Esfingomielina
Fosfatidiletanolamina
Cabeza hidrofílica y una o dos colas hidrofóbicas
Fluido bidimensional Fluidez de membrana Esteroles (colesterol)
PROTEÍNAS DE MEMBRANA
Funciones:
Transporte
Anclaje
Recepción
Enzimática
Tipos:
Integrales
Periféricas
Glicoproteínas
Proteoglicanos
TRASNPORTE
DE MEMBRANA
Proteínas:
Transportadoras
Canal
Tipos:
Activo
Pasivo
Difusión simple
UNIONES INTERCELULARES
Unión de anclaje
Uniones adherentes
Desmosomas
Hemidesmosomas
Uniones tipo contacto focal
Uniones ocluyentes
Ocludinas
Claudinas
GAP
Sinapsis
Complejo de unión
ESPECIALIZACIÓN DE LA SUPERFICIE CELULAR
Matriz extracelular
Proteínas fibrosas (colágeno y fibras elásticas) inmersas en un gel de glicosaminoglicanos.
Lámina basal
Células mesenquimales
Fibroblastos
Monocitos
Mastocitos
Linfocitos
Polimorfonucleados
Eosinófilos
Células plasmáticas
Macrófagos
Protínas:
laminina, cola´geno IV, nidógeno,...
Glicolsaminoglicanos (GAG):
hialuronán
Proteopglicanos (Proteínas+GAG):
decorina, percelán y agrecán.
Microvellosidades
Vainas de mielina
4. Citoplasma
INCLUSIONES
Glucógeno
COMPOSICIÓN
AGUA (hasta 85%)
PROTEÍNAS (20%)
LÍPIDOS (variable%)
ARNs (20%)
Inclusiones lipídicas
Inclusiones cristalinas
5. Ribosomas
6. Retículo endoplasmático
6a. Retículo endoplasmático rugoso (RER)
Lumen RE
Síntesis de proteínas
Formación membranas mitocondrias y peroxisomas
Sáculos aplanados y vesículas
Riboforinas canales
Función
Síntesis de proteínas



N-glicosilación



Transporte

Mal plegamiento
Disulfuro isomerasa
Chaperoninas y chaperonas BiP
Calreticulina
6b. Retículo endoplasmático liso (REL)
Red de túbulos unidos al RER
Todo el citoplasma
Función:
Síntesis/Almacenamiento/Transporte de lípidos


Procesos detoxificaión




Almacenamiento iones de Ca



Hidrosoluble a Lipolsoluble
HÍGADO
Retículo sarcoplásmico
Fosfatidilcolina
Colesterol
Ceramida
FUNCIONES RE
Síntesis de proteínas (R) y de lípidos (L) de membrana
Calidad plegamiento de proteínas (R)
Modificaciones post-traduccionales (R)
Detoxificación (L)
Acumulación de iones (L)
8. Transporte celular
9. Mitocondria
Composición
1000
por
célula
Membrana externa


Membrana interna


Espacio intermembrana


Crestas


DNAc


Mitorribosomas


Matriz
FUNCIONES
Fosforilación oxidativa
b-oxidación de los ácidos grasos
Síntesis de proteínas
Porinas
Sintesis y degradación de lípidos
Cardiolipinas
Crestas
Impermeable
Chaperonas
ATPsintasa
Genoma mitocondrial
Ribosomas mitocondriales
Enzimas
Oxidación Piruvato
Donde haga más falta
10. Microtubulos
6. Aparato de Golgi
El camino que siguen las proteínas
En el RE


Cisternas CIS del Golgi


Región intermedial


Cisternas TRANS del Golgi


FUNCIONES GOLGI
Síntesis de nuevos lípidos
Procesamiento de proteínas y lípidos
Formación de vesículas
O-glicosilación
Síntesis oligosacárido 14 azúcares
Identificación y eliminación de proteínas mal plegadas
O-glicosilación
Fosforilación de manosas
Eliminación de manosas
Eliminación de manosas y adición de N-acetilglucosamina, galactosa, ácido siálico.
Adición ácido siálico
Se sulfatan las tirosinas
13. El núcleo
CARACTERÍSTICAS
11. Filamentos de Actina
ACTINA
ENSAMBLAJE
12. Orgánulos fibrilares
CENTROSOMA
Dos centriolos




Material pericentriolar
14. Replicación celular
FASES
FASE M



FASE G1



FASE S



FASE G2



FASE G0
PUNTOS DE CONTROL
INICIO


TRANSCIÓN


CONTROL METAFASE
16. Diferenciación celular
FACTORES QUE INFLUYEN
Nucleares



Extrínsecos








Células madre
17. Muerte celular
Acumulación de errores dentro de la célula
Acumulación de errores dentro de la célula

Acortamiento de los telómeros

Alteración nuclear
Polimeriza para de los microfilamentos de actina, de tamaño muy reducido.
ACTINA G
ACTINA F
Monomeros
Polimerizada
1. Nucleación
2. Elongación
3. Estado estacionario
Unión dos monómeros de Actina G.
Se van uniendo dímeros hasta formar un complejo estable.
Se siguen uniendo monómeros de Actina G.
Unión de los monómeros de forma helicoidal.
Filamentos polarizado:
Extremo + (protuberantes)
Extremo - (puntiagudo)
ATP-Actina
ADP-Actina
Mismo número de proteínas de proteínas de actina hidrolizadas y polerizadas.
PROTEÍNAS ASOCIADAS
a-Actina
Fimbrina
Filamina
Tropomiosina
Espectrina
Estabilizadoras
Separación haces actina
Impide unión de miosina
Unión filamentos de actina
Formación redes 3D para gelificación del citoplasma
Células cancerosas no la expresan por lo que se mueven
Paralelas eje actina
Fortalecen filamentos actina
Fragmenta filamentos actina por el centro.
Paso de estado de gel a sol
Gelsolina
Miosina II
Contracción muscular.
Unión filamentos de actina a membrana plasmática.

DISTRIBUCIÓN
Zona periférica bajo la membrana
Delimitación de forma y movimiento
Estructuras especiales:
Córtex celular
Filopodios: Fagocitosis
Lamelipodios: Movimiento
Pseudopodos: Movimiento
Microvellosidades
Fibras de estrés: Presión
Unidos por centrina
3 tripletes de tubulina
Estructuras polares (satélites)
Inica el montaje de microtúbulos
CILIOS Y FLAGELOS
MICROFILAMENTOS MUSCULARES
Doble membrana
Seguido del RER
Contenido


Zonas "desocupadas"
Heterocromatina
Eucromatina
Nucleolo
rRNA
Proteínas
Condensada
Descondensada
Matriz nuclear
Nucleoplasma
LA MATRIZ NUCLEAR
Entramado de fibras

Regiones DNA con interación con protínas
Proteínas ácidas
SAR
MAR
HISTONAS
ENVOLTURA NUCLEAR
Complejo poro nuclear
Secuencia de señalización nuclear (NLS)
Importinas
RAN-GTP
RAN-GDP
Secuencia de exportación nuclear (NES)
Exportina
RAN-GTP
RAN-GDP
Los RNA
Ribonucleoproteínas
Para que el RNA sea reconocido por el poro y pueda salir del núcleo
NUCLEOLO
Centro fibrilar
Componente fibrilar denso
Componente granular
Pequeñas fibrillas muy finas
Rodea centros fibrilares
Gránulos de diferentes tamaños
Intersticios
Componentes preiniciación y factores iniciación transcripción
Unidades activas de transcripción
Suunidades ribosómicas inmaduras
Características
Mitosis
Desarrollo metabólico
Factores de crecimiento
Regulada por factores externos
Fallo desencadena tumores
Síntesis DNA
Síntesis proteínas
Síntesis de proteínas
Preparación mitosis
Momento de estancamiento
Deja de dividirse pero sigue viva
Quiescencia
Antes de la división
Busca daños en el DNA y los repara
Verifica que ha terminado la replicación
Controla formación huso mitótico
Correcta alineación de los cromosomas para que se dividan entre las células hijas
(Fase G2 - Fase M)
(Metafase - Anafase)
PROTEÍNAS DE REGULACIÓN
CICLINA D


CICLINA E


CICLINA A


CICLINA B
Unida a cdk4 ó 6
Señaliza entrada en G1 y fin de la mitosis
No está presente en todas las células
Unida a cdk2
Entrada en fase S y fin de la G1
Unida a cdk1 y 2
Presente en fase S
Unida a cdk1 y 2
Entrada célula en mitosis
Al proteolizarla se destruye el complejo MPF, que se sintetiza a la vez que la ciclina B.
cdk = complejo dependiente de kinasas
Todos los genes en todas las células
Regulación de la expresión
Genes heterocrómicos
Interacción entre células

Sustancias que difunden en el medio

Concentración de morfógenos

Interacción células con la matriz

Factores de crecimiento
Totipotentes a Pluripotentes a Multipotentes a Unipotentes
Apoptosis o muerte programada
Necrosis
Degradación de los cromosomas

Formación de vesículas

Eliminados por macrófagos
Rotura incontrolada de membrana

Salida enzimas líticas lisosomas

Respuesta inflamatoria
UNIDAD 2.
TÉCNICAS PARA ANÁLISIS CITOLÓGICOS

Acumulación de iones (L)
Las técnicas citológicas son fundamentales para el diagnóstico de tumores, función hormonal e infecciones parasitarias.
Dr. George Nicholas Papanicolau
INTRODUCCIÓN
Examinar grupos de células.
Herramienta sencilla.
Colección sencilla, económica y segura.

CLASIFICACIÓN ESTUDIOS CITOLÓGICOS
Investigación células atípicas en las secreciones líquidas o derrames.
Investigación células atípicas de raspado de mucosa o lesión de la piel.
Citodiagnóstico de células en suspensión obtenidas por PAAF
Citodiagnóstico de pieza operatoria no fijada por técnica de frotis o impresión.
Citología de detección precoz o exfoliativa
Citodiagnóstico inmediato
Células anormales, poco numerosas y muy alteradas.
Estudio poblaciones celulares sin alterar: morfología, densidad, cohesión, diferenciación y reacción celualr.
MÉTODOS DE PREPARACIÓN
Método directo
Método indirecto
Rica en células.
Poca cantidad de líquido.
PAAF, raspado, improntas...
Requiere de centrifugación para concentrar las células.
Orina y líquidos procedentes de lavados.
PROCESO
TIPOS DE MUESTRAS
Líquidos fisiológicos
Fluidos y líquidos patológicos
Frotis legrados
Piezas operatorias
OBTENCIÓN
FROTIS FIJADOS
Extendidos y fijados después de la obtención
Extensión uniforme
Fijados con cito spray
Se tiñen
Secreciones de mama, muestras de cepillados, otros.
FROTIS SECADOS AL AIRE
Extendidos y fijados después de la obtención
Secados al aire
Sin fijación
Fluidos líquidos o semisólidos
SIN SECADO NI FIJACIÓN
Muestras frescas
Fluidos líquidos o semisólidos
PROCESAMIENTO
EXTENSIÓN DIRECTA
Rudimentaria
Muestras de mucosa
Pasos
Seleccionar partes
Colocar en porta
Frotis
Fijación o secado
CENTRIFUGACIÓN
Aspecto inicial
Homogeneizar la muestra
Centrifugación (2000rpm 5 min)
Recoger sedimento
Extensión o citocentrifugación
CITOCENTRIFUGACIÓN
Cytospin.
Muestras giran sobre un porta formando mocapas de células.
Rápida para muestras líquidas.
FILTROS DE MEMBRANA
Concentración de células en muestras líquidas de baja densidad celular.
Membranas porosas (10-8 micras).
Millipore (acetato de celulosa) o Nucleopore (policarbonato).
Filtros SM.
Filtración por presión atmosférica o negativa de 25 mmHg (más fuerte romper células)
Fijación por etílico (95º).
Se tiñe el filtro.
FIJACIÓN
Conservar detalle morfológico
Deshidratación de las células, inactivación de enzimas, coagulación de proteínas y pentración en la membrana.
FIJADORES
FIJADORES ALCOHÓLICOS
Mayoría de los fijadores
Deshidratan y coagulan proteínas
Ventajas
Desventajas

Etanol 96º, metanol 100% y propanol e isopropanol 90%, mezcla de alcohol y éter a partes iguales (muy peligrosa por la volatilidad y "inflamabilidad" del éter.
La extensión se pone en un baño de 15 a 20' a RT o indefinidamente en la nevera tapado.
Rápidos
Volátiles e inflamables
NO ALCOHÓLICOS
Líquido de Carnoy

Citospray
Etílico puro, cloroformo y ácido acético.
Mezcla comercial de isopílico y polietilenglicol (evida desecación).
Pulverizar sobre la superficie del porta.
Simpleza y eficacia lo hacen muy usado.
Se elimina antes de teñir con baños en etanol 96º de 5 a 10' o teñir justo después de aplicarlo.

COLORACIÓN
Visualización óptima de las células.
Diferenciación constituyentes celulares.
Destacar núcleo y suavemente citoplasma.
Deben ser duraderos, sólo decolorarse por el paso del tiempo levemente.
OBJETIVOS
TIPOS
Tinción de Papanicolau
Estudio queratinización de las células malpighianas patológicas.
1925.
Tinción diferencial o policroma.
Tres colorantes:
Hematoxilina de Harris
Naranja G


Solución EA

La combinación comercial es EA-36,EA-SO y EA - &%. Puede interesar variarlo en función de lo que se busque.
Color azul oscuro a los núcleos.
Colorante citoplasma; Comercialmente OG-G; Tiñe de naranja queratina citoplasma (carcinoma epidermoide).
También contienen verde luz y pardo Bismark; Coloración citoplasma.
Tinción de Shorr
Excelentes resultados para evaluacuión hormonal vaginal.
Diferenciar células queratinizadas (naranja) de las que no los están (azules).
Núcleos azules.
Otros componentes como bacterias se distingues perfectos.
Detección de inclusiones intracitoplasmáticas que se tiñen de rojo vivo.
Tinción de May-Grundwald Giemsa
También denominada Pappenheim.

Material secado al aire en preparaciones de PAAF.

Son dos coloraciones sucesivas.

Más fina para el diagnóstico de malignidad.

Resalta: vacuolas, gránulas, colágeno, mucina,...
Coloraciones extermporáneas
Coloraciones rápidas.

Diagnóstico preoperatorio.
Coloración de Azul de Unna


Coloración de Giemsa
15'' monocroma; se ve bien la morfología como alteraciones nucleares
Alcohol metílico puro (1-2') seguido de colorante Giemsa (2').
Coloraciones especiales: Aranjado de acridina
Técnica histoquímica.

Fluorescencia de las células cancerosas debido a su exceso de DNA.

Material fresco y fijado.
UNIDAD 3.
PUNCIÓN POR ASPIRACIÓN POR AGUJA FINA (PAAF)

Acumulación de iones (L)
UN POCO DE HISTORIA
Primeras publicaciones de obtención de muestras humanas para el estudio de lesiones son de EE.UU.

La técnica de la PAAF se desarrolla en Europa tal y como la conocemos.

Primeros usos para detectar infecciones.

Memorial Hospital de NY:




Primera comunicación europea sobre la técnica es de 1931.

Paul López-Cardozo y Nils Söderström, son los creadores de la actual escuela europea.


El uso inicial fue para lesiones de fácil acceso, permitiendo diferenciar cuadros benignos de malignos.

Gracias a las técnicas radiológicas se pueden realizar punciones más profundas.
Podemos diferenciar dos grupos en función de las muestras.
Hayes Martin
Bradley Coley
Edward Ellis
Fred W. Stewart
Estudios de lesiones muy diversas, especialmente tumorales.
Agujas finas
Giemsa
Punción de órganos superficiales
Punción de órganos profundos
¿QUIÉN LA HACE?
Discusión entre los que no la quieren hacer.

La hace el que está más preparado.

A veces la hacen ambos.

Es una técnica que puede hacerse desde consulta externa o desde la unidad de patología.

Si la lesión está en un órgano no palpable se requiere:


Se requiere un consentimiento por escrito

Clínico Vs. Patólogo
Ecografía
Fluoroscopia
Tomografía axial
Resonancia magnética
Radiólogo
Consentimiento
informado
PREVIOS
Necesario controlar la información clínica.

Informe clínico no debe influir en diagnóstico.

Muy importante saber donde hay que llevar a cabo la punción.

El informe debe ser útil al patólogo.

Necesario un paciente tranquilo para evitar daños.

En punción de órganos profundos revisión a las 24 horas y recomendable sedación.
Orientación diagnóstica
MATERIAL
Material básico


Existen diferentes calibres de aguja en función del órgano del que se vaya a sacar la muestra.



Todas las "pistolas" admiten casi todos los tipos de jeringuillas utilizadas (10 ó 20 mL).

Antes de la punción todos los portas listos y marcados.

La zona de punción se limpia con alcohol y algodón.

Aguja & Jeringuilla
"Pistola"
Superficiales & blandos
Lesiones de consistencia elevada
Órganos profundos
Agujas cortas: 1.5-2.5 cm (longitud) y 0.4-0.6 mm (calibre)
Agujas cortas: 1.5-2.5 cm (longitud) y 0.8 mm (calibre)
Agujas cortas: 4.5-20 cm (longitud) y 0.8 mm (calibre)
Pistola Cameco
TÉCNICA
Sencilla.

Con una mano estirar la piel, con dedos sujetar el nódulo y con la otra mano realizar la punción.

Introducir la aguja con firmeza verticalmente, tirar del émbolo y con la presión negativa hacer varios movimientos de entrada y salida.

Nódulos superficiales a veces no hace falta más que la aguja.

Nódulo totalmente fijo.

Difícil atravesar un tejido fibroso de una región operada. Se entra por el lateral del tejido fibroso.

Cuatro tipos de punción:





Para órganos profundos no es necesario el tirador, vale sólo con la aguja, que se introduce en función a la información radiológica.

Obtener material no sólo del centro, puede estar necrosado.

Se realizan 3 punciones variando la entrada de la aguja.

En los quistes a veces hay que esperar a que se vacíen.

Material purulento se analiza microbiológicamente.
Próstata
Árbol bronquial
Control estereotáxico
Hueso
Fiador incorporado a un anillo que se coloca en el dedo.
Punción vía transbronquial con endoscopia.
Para punciones que requieren mucha precisión.
Agujas de dureza especial.
EXTENSIONES
La muestra se pone sobre portas. Bien hecho queda una elipse.

Quiste



Fijaciones



Control eficiencia de la técnica

Tinciones más habituales

Para ver componentes químicos como hierro, melanina,...








Una gota para extensión, resto centrifugación.
Alcohol-éter o alcohol 96º para tinción Papanicolau
Secar al aire para Giemsa.
Aerosol para material muy líquido
Glutarhaldehído 2.5% para ME.
Formol (2horas) para inmunoquímica.
DIFF-QUIK o Cytocolor.
Papanicolau, May-Grünwald-Giemsa y Hematoxilina-Eosina
Azul de Prusia, Fontana, Rojo Congo
INTERPRETACIÓN
Concordar la morfología de la preparación histológica con los grupos celulares obtenidos en la punción.
Valorar

Diferencias entre las muestras:

Frotis inflamatorio




Frotis dejidos normales y neoplasias benignas




Frotis lesiones malignas
Número, forma, composción, citoplasma, núcleo,...
Neutrófilos polimorfonucleados y necrosis.

Linfocitos con variedad morfológica.
Aguda

Suave
Grupos de células pequeños, cohesivos y monocapa.

Nucleos redoneados.
Más celulares que los benignos.

Grupos 3D.

Citoplasma amplio y vacuelado, bordes desflechados,...

Nucleolos grandes.
EL INFORME
Sistema de Bethesda.

Descripción de la lesión puncionada.

Resumen diagnóstico claro.

Si no se consigue diferenciar, recomendar estudio histológico.

CONTRAINDICACIONES
Coagulación buena para profundas.

Colaboración paciente.

Muestras intestinales, vasos importantes o quistes.
COMPLICACIONES
Raras ocasiones.

Paciente tumbado y sistema de recuperación al lado.

Sangrado y hematoma local; Neumotorax; Vasos importantes e intestino.

Puncionar grasa o músuculo liso que obstruyan la aguja.

Buen método para establecer protocolos e incluso estudiar proliferación, hormonas y genética.

Escasa estructura sanitaria.

Autopsias.
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