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Agarose gel extraction

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by

Koo Ja Hyun

on 11 October 2012

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Transcript of Agarose gel extraction

B-4 Agarose Gel Extraction Agarose gel 전기영동후 PCR product가 포함된 gel 조각으로부터 PCR product (증폭된 DNA)를 얻는다.

이는 PCR시 사용한 Taq polymerase, buffer 등으로부터 순수하게 DNA만을 분리하는 과정이다.

일반적으로 DNA purification 과정은 전기영동 후 gel에서 관찰되는 특정 size의 DNA band로부터 DNA를 유리해내는 것이다.

Gel 에서 DNA를 회수하는 많은 방법에는 low melting temperature agarose method, electroeluction, high salt extraction, freeze squeeze 등이 있다. Agarose gel extraction 원리 Agarose gel extraction 시약 시작 전 숙지사항 Agarose gel extraction 방법 Protocol Agarose gel extraction 방법 QG buffer의 yellow color는 pH<7.5라는 의미

PE buffer를 사용하기 전에 ethanol(96~100%)을 첨가한다.

모든 Centrifugation 단계는 실온의 microcentrifuge에서 실행한다.(12.000rpm)
우리가 찾은 Agarose gel extraction 방법은 QIAquick Gel extraction kit을 이용한 방법 이다. QG buffer : gel을 녹이는 역할을 하는 버퍼

Isopropanol : DNA가 컬럼에 잘 붙게하는 역할

두번째 QG buffer : agarose 찌거기를 제거

PE buffer

Washing buffer로 DNA의 순도를 높여주는 역할을 한다. 사용하기 전에는 ethanol(96~100%)을 첨가한다.

EB buffer(elution buffer)

buffer resin에 DNA만 남아있을때 넣음으로써 resin과 DNA와의 binding affinity(결합친화력)을 감소시켜 DNA만의 순수히 용출시키게 된다. Gel Extraction 영상 1. Agarose gel로부터 DNA조각을 깨끗하고 날카로운 메스로 절개한다.

A. 여분의 agarose를 제거하여 gel의 조각의 크기를 최소화 하는게 좋다. 방법 방법 방법 2. 투명한 tube에 넣은 gel조각의 무게를 측정한다. 이때 gel 1 volume 에 QG buffer 3 volume 을 첨가한다.

A. 예를 들면 gel 100mg당 QG버퍼 300ul을 첨가한다. (2% agarose gel의 경우는 버퍼를 6volume 첨가한다)

B. QIAquick column당 최대 gel 조각의 최대양은 400mg이다. 400mg을 초과 하는 gel 조각에 대해서는 다른 QIAquick column을 사용하도록 한다. 3. 50℃에서 10분간 incubation 한다.
(gel 조각이 완전히 녹을 때 까지)

A. 주의할점 : agarose를 완전히 용해 한다.

B. 2% 초과 하는 gel에서는 incubation 시간이 증가한다. 방법 방법 방법 5. 1gel volume에 1 volume 만큼의 isopropanol을 넣고 혼합한다. (5분간)

A. 예를 들어, 만약 agarose gel 조각이 100mg라면 100ul의 isopropanol을 첨가한다.

B. 이 단계에서는 centrifuge가 필요 없다. 6. 이렇게 나온 DNA정제를 위해 QIAquick column에 sample을 넣고 1분 반응후 1분간 centrifuge 한다.

A. column의 최대 가용량은 800ul 이기 때문에 800ul 이상의 sample은 과정을 반복한다. 4. Gel 조각이 완전히 용해된 후 혼합물이 yellow color를 띄는지 확인한다.
(agarose 가 없는 QG buffer와 유사하다)

A. 만약 혼합물의 색이 Orange 또는 violet일 경우 3M sodium acetate pH 5를 첨가하여 혼합한다

B. QIAquick column에 DNA의 흡착되기 위해서는 pH 7.5이하의 조건이 필요하다.

C. QG 버퍼는 pH 지시약을 함유하여 pH 7.5 이하에서는 yellow를 띄고 pH 7.5 이상에서는 orange or violet 색을 띈다. 이로써 DNA binding을 위한 최적 pH를 결정 할 수 있다. 방법 방법 방법 7. centrifuge된 여과액은 버리고 QIAquick column를 따로 다시 모은다.
(이단계의 QIAquick column 에는 DNA가 붙어 있는 것이다.) QIAquick column의 모습이며 우리가 생각하는 크로마토 그래피의 column과 다름 8. 추가 단계이지만 QG 버퍼 0.5ml을 QIAquick column에 넣고 1분간 centrifuge 한다. centrifuge가 완료 되면 여과액은 버린다

A. 이 단계에서 agarose의 모든 흔적이 제거된다.

B. 이 과정은 Sequencing, microingection 에 사용될 DNA를 정제하기 위할 때만 필요하다. 9. 세척을 위해 PE 버퍼 750ul을 따로 모은 QIAquick column에 첨가하여 3분 반응 후 1분간 centrifuge 한다. (PE 버퍼를 사용하기 전에는 ethanol(96~100%)을 첨가한다-ethanol의 강한 휘발성으로 인해 사용 직전에 넣어 준다)

A. blunt-end ligation 이나 direct sequencing 같은 민감성 반응의 목적을 위해 사용하는 DNA는 column을 centrifuge 하기 전에 PE 버퍼 첨가후 2~5분 정도반응 해준다. 방법 방법 10. 여과액을 버리고 QIAquick column을 1분간 centrifuge 한다.

A. 중요!: 이 단계에서 추가적인 centrifuge를 하기 전에 여과액을 버리지 않는 한 PE 버퍼에서 남은 ethanol은 여전히 제거되지 않는다. 11. QIAquick column을 새로운 1.5 ml microcentrifuge tube에 넣은후 5분간 건조시킨다.

A. 이 과정에서 에탄올을 모두 날려 버린다. 방법 방법 방법 12. DNA를 녹여서 분리하기 위하여 EB buffer 50ul(10mM Tris-Cl, pH8.5) 를 넣고 5분간 반응 시킨다. 5분간 centrifuge 한다.
튜브에 침전된 정제 DNA를 -4C에서 냉동 보관 한다. 빨간 상자 부분이
우리 실험의 부분이며
동그란 화살표는 원심분리를 말함 건조 되어진
pellet
(즉 DNA가 담겨진 column) 200821282 김 한 의
200921299 백 승 운
200921335 임 성 민
201121226 김 수 진
201121191 신 철 우
201121215 구 자 현
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