Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

LBMG1. Extracción de Acidos Nucléicos

No description
by

Adriana Mendizabal

on 28 August 2018

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of LBMG1. Extracción de Acidos Nucléicos



.

cantidad de DNA en el tubo -[19.4 ng/µL]
Extracción de Acidos Nucléicos
¿Y cuanto necesito?
en.wikipedia.org
¿Cuanto DNA puedo obtener de mi muestra?
¿Como te deshaces de todo lo demás?
¿Como puedes tener acceso al DNA?
By Kelvinsong - Own work, CC0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=22952603

1. Nucleolus
2. Nucleus
3. Ribosome (little dots)
4. Vesicle
5. Rough endoplasmic reticulum
6. Golgi apparatus (or "Golgi body")
7. Cytoskeleton
8. Smooth endoplasmic reticulum
9. Mitochondrion
10. Vacuole
11. Cytosol (fluid that contains organelles, comprising the cytoplasm)
12. Lysosome
13. Centrosome
14. Cell membrane

DNA
¿En donde?
http:// www.sonefe.org /online- biyoloji - dersleri /grade-9/discovery-of-cells/.
1. Lisis celular (Romper membrana o pared celular)
2. Eliminar
3. Aislar
proteínas
Lípidos
Otros deshechos celulares
Extracción y Purificación
Numero de células
Células viables, células con DNA
Tamaño del genoma
Actividad
Métodos de fragmentación, lisis celular
Debe tener la fuerza necesaria para romper el material celular o tejido pero la delicadeza requerida para preservar los ácidos nucléicos de interés
Físicos
Químicos
Proponga al menos 2 formas para romper la célula, de ser posible explique muy brevemente su fundamento
Enzimáticos
Mecánicos
: Se basan en las fuerzas de corte que deforman las células hasta el rompimiento
No mecánicos:
Rompen las cubiertas celulares induciendo lisis a través de medios físicos, químicos o enzimáticos
Homogenización
Sonicación
Solventes orgánicos: (cloroformo)
Álcalis: (hidróxido de sodio)
Agentes Caotrópicos: (clorhidrato de guanidina)
Agentes Quelantes (EDTA)
Detergentes (SDS)
Congelamiento/descongelamiento
Termolísis (calentamiento)
Lisozima
Proteasas (Proteinasa K)
Lyticasa
Combinados
By derivative work: Dhatfield (talk)Cell_membrane_detailed_diagram_3.svg: *derivative work: Dhatfield (talk)Cell_membrane_detailed_diagram.svg: LadyofHats Mariana Ruiz - Cell_membrane_detailed_diagram_3.svg, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=4228810
Actividad
Elija a un organismo de la tabla y calcule la cantidad de DNA que se podría obtener a partir de una célula
1. Calcule el peso en gr

Preguntas
¿Se debe considerar el tipo de muestra a procesar para este paso?
El estado de la muestra?
La recolección y resguardo?
El tipo de tejido?
El tipo de célula?

¿Hay algún paso antes de la extracción?
Tarea 1:
Explique como funcionan cada uno de los métodos químicos
que se acaban de listar
Después de la lisis, que tenemos en la mezcla?
Table 1 DNA extraction methods commonly used for extraction from whole blood samples
Chacon-Cortes, Diego, and Lyn R. Griffiths. J. Biorep Sci App Med 2014, 2: 1-9.
Extracción orgánica y Digestión enzimática
Orgánicos (fenol-cloroformo)
No-orgánicos (Proteinasa K y sales)
Membranas de nylon/NMC
Recuperación y concentración del DNA
En los métodos de extracción orgánica o de sales el DNA queda en una solución acuosa

El DNA se precipita para "rescatarlo" utilizando una sal y etanol(mas frecuentemente) o isopropanol
Las Proteínas
Separación con sales

columnas de extracción

Perlas magnéticas
Las sales se asocian con los grupos cargados
EN concentraciones altas de sal las proteínas se deshidratan por lo que pierden solubilidad y precipitan
El DNA queda en el sobrenadante
Cloruro de sodio, acetato de potasio, acetato de sodio
Inactivación de Nucleasas
Eliminar RNA
Separación selectiva por union a un soporte sólido
El DNA es polar por lo tanto insoluble en solventes orgánicos
Aunque el DNA es poco soluble en etanol, en presencia de sal (NaCl) incrementa su insolubilidad porque la sal neutraliza las cargas de los grupos fosfato causando que el DNA se vuelva menos hidrofílico por lo que precipita
intercambio ionico
adsorcion a sílica
intercambio reversible de los iones en solución con los grupos funcionales unidos covalentemente a una fase estacionaria insoluble llamada resina.
Métodos mas comunes utilizados para extracción de DNA
Práctica. Extracción de DNA a partir de Procariontes
Sembrar en caldo Lenox o CST.
Incubar a 37°C de 24 a 48 h.

Centrifugar a 4000 rpm por 10 min
Descartar el sobrenadante
Resuspender en búfer de lisis (10mM Tris-HCl, 5mM EDTA, pH 8)
Agregar 15 microL de lisozima (100 mg/mL)
Incubar a 37°C por 1 hora
Adicionar 26 microL de Dodecil sulfato de sodio (SDS) al 20%

Buffer con Tris.
mantiene el pH de la solución estabilizando al DNA
SDS
. Rompe las membranas celulares y nucleares , tambien desnaturaliza y desdobla proteínas
Lisozima
. Actua sobre la capa de peptidoglicanos de la pared celular de la bacteria
Proteasa
. destruye las proteínas nucleares unidas al DNA asi como las enzimas citoplasmáticas que destruyen al DNA = Mas DNA intacto
Adicionar 0.5 L de proteinasa K (18,000 g/mL)
Incubar a 55°C (5 min)

Añadir 800 microL de fenol-cloroformo-alcohol isoamilico (25:24:1)
Agitar 1 min
Separar las fases 14,000 rpm/10 min
1. Fase acuosa- DNA
2. Interfase: Proteínas
3. Fase orgánica: RNA, lípidos
Fenol. Precipita proteínas y lípidos
Cloroformo. Se une a los compuestos no acuosos y los precipita (lípidos, proteínas)
Ejemplo. Método de Miller
Práctica. Extracción de DNA a partir de Eucariontes
1.- 3 ml de sangre (EDTA)
Agregar 3 ml TTS (Tris-Tritón-Sacarosa)= RBC lysis Buffer

Centrifugar 10 min a 3,000 rpm.
Decantar

1 ml TTS y pasar A un tubo ependorf
Agitar y Centrifugar 12,000 rpm, 2 min
Lavar.
Decantar
570 l de NaCl 5 mM
Y agitar 2 minutos
+ 30 l de SDS 10%
Y agitar 15 minutos
Centrifugar
Precipitación con etanol y lavados
A partir de saliva
Extracción de RNA
Considerados como el "gold standard"
Homogenización en una solución que tiene fenol seguida de centrifugación para separa las fases
Se recolecta el RNA de la fase acuosa superior y se precipita con etanol
Con Base en Filtros, formato de columnas
Utilizan membranas fijas (fibra de vidrio, silica o de intercambio ionico)
Se lisan las muestras en un beffer que contiene inhibidores de RNasas (sales de guanidina)
El lisado se pasa por la columna y se centrifuga de modo que los ácidos nucleócos se unene a las membranas
Se agregan soluciones de lavado que se van descartando despues de centrifugación.
Se agrega un buffer de elusión para liberar al RNA de la membrana.
Con partículas magnéticas
Problemas con el RNA

Es químicamente inestable. Ocurre rompimiento espontáneo del esqueleto de fosfodiéster por transesterificiación intramolecular.

Es susceptible a a la degradación por RNasas que son casi ubicuas (las RNasas se liberan con la lisis celular, están presentes en la piel, son muy difíciles de inactivar)
Tarea 2
El que mas se emplea es el método de extracción de tiocianato de guanidinum-fenol-cloroformo (Trizol)
Gradiente de cloruro de cesio
Precipitacion con sales
¿Que tiene DNA?
¿Todas las celulas?
¿En donde?
Estructura de las membranas
EL peso promedio de una par de bases es de 650Da, se pude expresar también como:
1 pb = 650g/mol = masa molar
Ej. ¿Cual es el peso molecular de un plásmido de 5.2 kb (5200pb)?

5,200 bp x 650 daltons = 3,380,000 daltons o g/mo
Conociendo la cantidad de DNA que tenemos y la longitud del templado y utilizando el num
de Avogadro (molecules/mole)
podemos calcular el numero de moléculas de templado por gr
¿Cuanto DNA obtuve?
¿Como puedo cuantificar los ácidos nucléicos?
Investigar cuales son los inhibidores de las RNAsas que se pueden utilizar
Separar-Eliminar
Leer el artículo: "
Comparación de tres métodos de extracción de ADN a partir de restos óseos
." Revista de biología tropical 52.3 (2004): 717-725.

Espectrofotometría
. Método que mas se emplea
Con base en la absorbancia a 260nm
Por
fluoresencia
. (por ejemplo picoGreen)
Tarea
1 Calcule la concentración (en ng/microL) de las siguientes muestras.
*
2. Conteste que muestras del cuadro son buenas y porque.
1. ¿Cual es la razón de utilizar huesos como fuente de DNA?
2. ¿Que desventajas tiene este tipo de muestra?
3. Realice un diagrama de flujo muy general sobre la metodología que se empleo en el artículo
4. ¿En que aspectos variaron los métodos que se compararon?
5. ¿Cual razón dan par explicar la variación en la concentración ente las muestras?
6. ¿Como determinaron la presencia de: contaminación por proteínas, carbohidratos, RNA?
7. ¿Como determinan la degradación?
8. En caso particular, ¿es bueno tener RNA? (explique porque)
9. Cual fue el mejor método, explique
10¿Que otros factores pueden influenciar los resultados obtenidos en la extracción de ácidos nucleicos?

Actividad en equipo
Metodos Orgánicos
The Sci Guys: Science at Home - SE2 - EP15: Extracting Strawberry DNA
Canal: The Sci Guys
1
Actividad 3
* IMPORTANTE!
Estos datos se obtuvieron con el NANODROP y no se realizo dilución.

En el caso de algunos equipos
como el espectrofotómetro Nanodrop, no es necesario diluir la muestra.
Ilustre el procedimiento y anote los cálculos
# de copias =
( Cantidad de DNA que tienes en ng *
6.022x1023
)
(Longitud del DNA en pb * 1x109 * 650)
Para convertir a ng
1 mol de pb = 650g
Caso
.
Un virus nuevo causante de una enfermedad gastrointestinal que acaba de ser caracterizado tiene una longitud de 359453 pb.

Al parecer los extractos de una planta indígena tienen efectos sobre este eliminándolo.
Para medir el éxito del tratamiento es necesario hacer un seguimiento determinando la carga viral después de cada tratamiento.
Usted tiene 19.4 ng/el DNA del virus aislado en un tubo.

1. Cuantas copias por µL tiene?
2. Prepare las siguientes diluciones:
5, 000,000 copias/μL
500,000 copias/μL
50,000 copias/μL

Para medir la carga viral se utilizará PCR en tiempo real la cual utiliza una curva de concentración de referencia, sin embargo no existen aun los estándares comerciales para preparar esta curva por lo que deberán prepararse en su laboratorio
Cuantificación
¿Es importante saber cuanto puedo obtener?
Asegúrate de que:
Diferencies los conceptos de extracción y purificación

Puedas describir las etapas básicas del procedimiento general para extracción y purificación de ácidos nucleicos y reconozcas el objetivo de cada uno

conozcas la función de cada uno de los reactivos utilizados en el proceso de extracción y purificación
Absorción de la luz
Se utiliza para detectar y cuantificar (espectrofotómetricamente) en una solución:
bases
nucleósidos
nucleótidos
ácidos nucleicos (260 nm)

Para determinar la "pureza" de los ácidos nucléicos en dilusión:

Se utiliza la relación con las proteínas (280 nm) y otros componentes que pudieran estar presentes (230 nm).

A 260/A 280 = 1.8 -2.0

Las bases de los ácidos nucléicos absorben Luz UV en con un patrón específico de absorción (absorción max a longitud de onda específica)
Los residuos de triptofano absorben a esta long.
< 1.8 contaminación con proteínas o fenol

para RNA es cercano a 2
La Absorbancia es frecuentemente intercambiable por Densidad Optica

La constante de Absorción para el DNA es de 50 y para el RNA de 40

La concentración obtenida en la mayoría de las extracciones de DNA o RNA dará lecturas que sobrepasan el rango de lectura de muchos de los espectrofotómetros, por lo tanto es necesario hacer una dilución.

Una unidad de D.O o absorbancia a 260nM es igual a 50mg/L (o 50 microg/mL) de DNA
A partir de un cultivo celular se purifico el DNA de un plasmido recombiante. El DNA obtenido se resuspendio en 50 µg de Agua estéril.

Se diluyeron 20 µL del DNA reconstituido en un volumen total de 1000 µL de agua destilada. La absorbancia de esta dilución fue la siguiente:
A260 = 0.550
A280 = 0.324
Cual es la concentración de la muestra de DNA (de los 50µL)
X  µg DNA/mL
0.550 OD
50 µg DNA/mL
1 OD
X  µg DNA/mL
50 µg DNA/mL
1 OD
0.550 OD
x = 27 µg DNA/mL
esta es la concentración del DNA en la dilución que se leyó
Para calcular la concentración en los 50µL de la muestra se tiene que considerar el factor de dilución que se empleo:
27 µg DNA/mL
1000
20
= 1375 µg DNA/
m
L
= 1.375 µg DNA/
µ
L
Algunos equipos están diseñados específicamente para el análisis de ácidos nucleicos y pueden programarse para hacer los cálculos directamente.

En algunos de estos equipos (como nanodrop) no es necesario hacer una dilución.
En total, cuanto DNA se purifico del plásmido?
1.375 µg DNA/µL
50 µL
= 68.75 µg DNA
Concentración ADN (µg/mL) = (
factor de dilución
) (50 µg/ml) (D.O260)


Factor de dilución =
Vol. total de la dilución
Vol. de la muestra para dilución
Rendimiento ADN (μg) = (Concentración ADN) x (volumen total de la muestra)
Solo si se diluyó
Mide la concentración del DNA asociado a colorantes fluorescentes.
Tiene una alta sensibilidad
Es necesario utilizar un estandar y calibrar antes de hacer las lecturas.
Puede haber discordancia entre las concentraciones obtenidas por espectrofotometría (reconocen diferentes blancos, los agentes fluorescentes no se unen a nucleótidos libres)
Full transcript