Loading presentation...

Present Remotely

Send the link below via email or IM

Copy

Present to your audience

Start remote presentation

  • Invited audience members will follow you as you navigate and present
  • People invited to a presentation do not need a Prezi account
  • This link expires 10 minutes after you close the presentation
  • A maximum of 30 users can follow your presentation
  • Learn more about this feature in our knowledge base article

Do you really want to delete this prezi?

Neither you, nor the coeditors you shared it with will be able to recover it again.

DeleteCancel

Make your likes visible on Facebook?

Connect your Facebook account to Prezi and let your likes appear on your timeline.
You can change this under Settings & Account at any time.

No, thanks

Presentación tesina

Estandarización y optimización de reacciones de PCR
by

GISELA LAZZARINO

on 26 March 2014

Comments (0)

Please log in to add your comment.

Report abuse

Transcript of Presentación tesina

Tesina para acceder al título de Lic. en Biotecnología
1.

INTRODUCCIÓN

2.
OBJETIVOS

3.

METODOLOGÍA Y RESULTADOS

4.

CONCLUSIONES

Sepsis
1)
Estandarización de una PCR para la detección de ADN
4- Diseño de oligonucleótidos
• Se obtuvieron bacterias transformadas con fragmentos de DNA de microorganismos controles (
C. albicans, S. aureus
y
E. coli
) que podrán ser utilizadas posteriormente como controles positivos de las reacciones de PCR.
• Se confirmó que los oligonucleótidos panfúngicos permiten identificar con un 100% de especificidad hongos
Ascomycetes
(
Candida
spp.,
Aspergillus
spp.),
Mucormycetes
(
Rhizopus microsporus
) y
Basidiomycetes
(
Malassezia
spp.,
Cryptococcus
spp. y
Rhodotorula
spp.). Estos seis géneros fúngicos son los causantes de más de un 99% de las funguemias y micosis profundas.
• Los oligonucleótidos panbacterianos Gram positivos permitieron identificar
Staphylococcaceae
(
Staphylococcus
spp.),
Streptococcaceae
(
Streptococcus
spp.) y
Enterococcaceae
(
Enterococcus faecalis
) que son los grupos de bacterias Gram positivas más comunes aislados en bacteriemias.
¡Gracias!
Gisela Paola Lazzarino
Directora: Dra. María Soledad Gamarra
"Estandarización y optimización
de reacciones de PCR individuales
para el diagnóstico de funguemias y bacteriemias utilizando ácidos nucleicos de organismos controles"

Estado inflamatorio generalizado = SRIS (Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica).
Presencia confirmada de microorganismos en sangre.
Sepsis
Septicemia
Bacteriemia/Funguemia
Septicemia
Estado inflamatorio generalizado = SRIS (Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica).
Infección sanguínea no confirmada.
Bacteriemia
Ausencia de síntomas clínicos.
Presencia confirmada de bacterias en sangre.
Funguemia
Ausencia de síntomas clínicos.
Presencia confirmada de hongos y levaduras en sangre.
Invasión al torrente sanguíneo por microorganismos
Entrada directa
Diseminación desde un foco de infección primaria
Agujas
Catéteres
Prótesis
Sistema linfático
Invasión al torrente sanguíneo por microorganismos
Dependientes del huésped
Derivados de tratamientos e intervenciones médicas
Factores
SI ineficiente
Edades extremas
Lesiones en piel
Falla médica
Tratamientos prolongados
Procedimientos invasivos
250 000 septicemias/año
Tasa de mortalidad: 20-50%
(invariable en 20 años)
Principal causa de muerte por enfermedades infecciosas (Dirección de estadísticas e información de la salud)
> 10 000 muertes anuales
Tasa de mortalidad: +1,3% 1997-2011
(26,3 cada 100 000 en 2011)
1970 - 1980
1990
2000
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
Klebsiella pneumoniae
Pseudomonas aeruginosa
Bacteroides fragilis
Enterococcus
spp.
Streptococcus pyogenes
Candida albicans
Proteus mirabilis

Staphylococcus aureus
Escherichia coli
Staphylococcus coagulasa negativos
Klebsiella pneumoniae
Enterococcus spp.
Pseudomonas aeruginosa
Streptococcus pneumoniae
Streptococcus viridans Candida albicans
Enterobacter cloacae


Staphylococcus coagulasa negativos
Staphylococcus aureus
Enterococcus spp.
Candida spp.
Escherichia coli
Klebsiella spp.
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter spp.
Serratia spp.
Acinetobacter baumanii


Staphylococcus
coagulasa negativos
S. aureus
K. pneumoniae
Enterobacter
spp.
E. coli
Acinetobacter
sp.
Serratia
spp.
S. pneumoniae
Candida
spp.
P. aeruginosa

S. aureus
Staphylococcus
coagulasa negativos
E. coli
S. pneumoniae
Enterococcus
spp.
P. aeruginosa
K. pneumoniae
Gram negativos no fermentadores
Anaerobios

Enterobacter
spp.


Niños
Adultos
Orden de incidencia
Orden de incidencia
Orden de incidencia (%)
Hospital San Martín (Paraná)
2009
2010
2011
S. aureus
38 32 33
E. coli
17 10 16
S. pneumoniae
1 12 13
K. pneumoniae
7 8 5
P. aeruginosa
6,4 8,5 4
E. faecalis
0 3 3
C. albicans
2 0 0
A. baumanii
2 1,5 3
¿Cómo se diagnostica actualmente?
Cultivo de sangre + Identificación fenotípica
"Gold Standard"
Específico
Sensibilidad limitada
LENTO
Cultivo inicial (8 - 24 hs)
Si hay crecimiento
Subcultivo
18-24 hs para bacterias
40 d para micobacterias
24 hs - 45 d para hongos
Identificación definitiva (24hs)
Evaluación de la sensibilidad a los antimicrobianos (24 - 48 hs)
TOTAL: 3 días
Disminución de los tiempos de diagnóstico
Disminución de los costos hospitalarios
Menor:
ATB
estudios/paciente
días de internación
terapias de soporte
Disminución de los efectos secundarios
Disminuye la resistencia ATB
• Estandarización de una PCR individual para la detección de DNA fúngico (PCR panfúngica).
• Estandarización de una PCR individual para la detección de DNA de bacterias Gram positivas (PCR panbacteriana Gram positiva).
• Estandarización de una PCR individual para la detección de DNA de bacterias Gram negativas (PCR panbacteriana Gram negativa).
• Evaluar la sensibilidad y especificidad de la metodología utilizando distintos inóculos de microorganismos controles y distintos métodos de extracción de ácidos nucleicos.
• Obtener fragmentos de DNA estables para ser utilizados como controles positivos en las reacciones de PCR del kit diagnóstico.
OBJETIVOS
Métodos de cultivo mejorados
Sistemas automatizados de cultivo
Aumento sensibilidad
Inactivación agentes ATM
Detección rápida del crecimiento
Mejora detección MO fastidiosos
Nuevos
Medios de cultivo
Medios de detección de crecimiento
Técnicas de recolección y cultivo
Técnicas alternativas al cultivo
Detección AN
PCR
PCR
1993 - Primer método de diagnóstico
Ventajas
Elevada sensibilidad y especificidad
Mínimas [DNA] (pg/ml)
Amplifica a partir de una sola molécula DNA
Diagnóstico rápido y eficaz
Región a amplificar (oligontds)
N° copias gen diana / Genoma
Plataformas comerciales disponibles para el diagnóstico
SeptiFast (Roche)
Diagnóstico basado en qPCR
Detección: bacterias G+, bacterias G- y hongos a partir de sangre
Sensibilidad: 30 a 100 UFC/ml
NASBA-MB (bioMérieux)
(Amplificación Basada en la Secuencia de AN)

Amplifica mRNA

Velocidad del diagnóstico (5 hs)
Sensibilidad relativamente baja
No diferencia contaminantes ni células muertas
Muchas copias de mRNA / copia génica
Única T de amplificación (41°C)
Detección: bacterias G+, bacterias G- y hongos a partir de sangre
Sensibilidad: 1-55 UFC/ml
Detecta células viables solamente
RNA frágil e inestable
$ (u$s 100000)
Equipos y reactivos costosos
• Los oligonucleótidos panbacterianos Gram negativos permitieron identificar
Enterobacteriaceae
(
E. coli
,
Serratia
spp.,
E. cloacae, P. mirabilis
),
Pseudomonadaceae
(
P. aeruginosa
) y otras bacterias no fermentadoras de lactosa (
Acinetobacter baumanii
).
Diagnóstico molecular basado en rDNA y rRNA
Ribosomas
Complejos macromoleculares de ribonucleoproteínas y rRNA
Constituídos por subunidad mayor y menor
Procariota (70S) Eucariota (80S)
Subunidad mayor
50S (5S, 23S) 60S (5S, 5.8S, 28S)
rRNA
Codificados por rDNA (operón ribosómico)
Procariota
Eucariota
Ideal para diseño de oligonucleótidos de diagnóstico
Alto n° copias/ genoma (aumenta sensibilidad)
Secuencias muy conservadas (permite amplificar DNA de organismos desconocidos)
Fúngico
Bacteriano
G+
G-
1 - Análisis de la epidemiología
Se determinaron los ppales mo causantes de bacteriemias y funguemias:
23 sp fúngicas
68 sp bacterianas
(23 G+ y 45 G-)
2 - Búsqueda secuencias nucleotídicas de genes que codifican rRNA
Página web NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov)
3- Alineamiento de secuencias para diseño de oligonucleótidos
Clustal W con BioEdit Sequence Alignment Editor v7.1.3.0
Regiones conservadas
Tm = 60°C (aprox.)
Producto de tamaño medio (para < t elongación)
No hibridaciones inespecíficas
Diseñados
1 - Cultivo de mo
Cepas fúngicas (20):

Ascomycetes
(14)
Mucormycetes
(1)
Basidiomycetes
(5)
PDA
Aspergillus
spp. y
Rhizopus
spp.
ASG
Candida
spp.,
Cryptococcus neoformans
y
Rodotorula
spp.
Agar Dixon modificado
Malassezia
spp.
48 – 96 horas a 28°C
Cepas bacterianas (11):

G+: familias
Staphylococcaceae, Streptococcaceae y

Enterococcaceae
G-: familias
Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae
y otras bacterias no fermentadoras de lactosa
CLDE Todas las cepas
Agar Sangre
S. pneumoniae
35°C - 24hs
2 - Extracción de DNA
Hongos y levaduras método de fenol-cloroformo


Incubación con RNAsa A (1 hora - 37°C )

Corrida en gel de agarosa al 0,8%.
fenol-cloroformo
Bacterias calentamiento
PCR Panfúngica
Con las 19 especies fúngicas:
2 enzimas termoestables
1 par de oligonucleótidos (600pb)
Taq Pegasus (Embiotec, Arg)
Taq de Fermentas (Tecnolab, Arg)
PCR Panbacteriana Gram +
3 - PCR
PCR Panfúngica
PCR Panbacteriana Gram +
PCR Panbacteriana Gram -
Vol final 25 μL
[oligonucleótidos], [dNTPs] y [MgCl2] optimizadas previamente
Estandarizar
(para controles y sensibilidad)
Polimerasa
Programa de amplificación
Taq Pegasus (Embiotec, Arg)
Taq de Fermentas (Tecnolab, Arg)
Controles:
C. albicans
(+),
S. aureus
(-),
E. coli
(-)
BR: H2Od
Controles:
S. aureus
(+),
E. coli
(-),
C. albicans
(-)
BR: H2Od
PCR Panbacteriana Gram -
6 especies bacterianas G-:
2 enzimas termoestables
4 pares de oligonucleótidos


1 programa de amplificación

Controles:
E. coli
(+),
S. aureus
(-),
C. albicans
(-)
BR: H2Od
PCR Panbacteriana Gram -
Condición I:
Enzima Taq Pegasus (Embiotec, Arg)
Oligonucleótidos:
16S I (250pb) - A
16S II (350pb) - B
16S III (350 pb) - C
23S (400 pb) - D
PCR Panbacteriana Gram -
Condición II:
Enzima Taq Pegasus





3 digestiones controladas con DNAsa I
Oligonucleótidos:
16S I (250pb)
16S II (350pb)
16S III (350 pb)
23S (400 pb)
10 U Taq Pegasus + 5 U DNAsa I
10 U Taq Pegasus + 5 U DNAsa I
10 U Taq Pegasus + 10 U DNAsa I
37°C, 10 min - 95°C, 5 min
25°C, 15 min - 70°C 10 min
Ciclado total: 1.30 hs
Polimerasa producida en forma recombinante en
E. coli
y mal purificada
PCR
No se obtuvo producto de amplificación
Otros métodos: ER, ultrafiltración, UV, 8-MOP
PCR Panbacteriana Gram -
Condición III:
Enzima Taq Fermentas (Tecnolab, Arg)





Oligonucleótidos:
16S I (250pb)
16S II (350pb)
16S III (350 pb)
23S (400 pb)
Producto de amplificación en
S. aureus
(-)
2)
Evaluar la sensibilidad y especificidad de la metodología utilizando distintos inóculos de microorganismos controles y distintos métodos de extracción de ácidos nucleicos.
4 - Secuenciación
Productos de PCR
C. albicans
(28S)
E. coli
(23S)
S. aureus
(16S
)
Dideoxi secuenciación (Sanger) por Cromátida (Bs.As., Arg.)
Análisis BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)
99% concordancia
1 - Cálculo de [DNA]
Muestras de DNA
dil 1/50
C. albicans
ATCC 36082
S. aureus
ATCC 25923
E. coli
ATCC 25922
(extracción por fenol-cloroformo y por calentamiento)
A260/A280
2750 ng/μL
1000 ng/μL
1950 ng/μL
2 - PCR
[DNA] conocidas de:
C. albicans
ATCC 36082
S. aureus
ATCC 25923
E. coli
ATCC 25922
PCR
C. albicans
S. aureus
E. coli
3- Determinación del n° de copias
C. albicans
2,75 x10^-5 ng/μL
detecta hasta
si
740 UFC/ml
1 UFC = 37 fg DNA
S. aureus
1 x10^-3 ng/μL
detecta hasta
si
3,3 x10^5 UFC/ml
1 UFC = 3 fg DNA
E. coli
1,95 x10^-2 ng/μL
detecta hasta
si
3,9 x10^6 UFC/ml
1 UFC = 5 fg DNA
Sensibilidad
Podría mejorarse realizando las extracciones de DNA con kits comerciales o adaptando bien el método de fenol-cloroformo
3)
Obtener fragmentos de DNA estables para ser utilizados como controles positivos en las reacciones de PCR del kit diagnóstico.
1 - Ligación inserto-vector
Producto de PCR purificado con el kit "
AccuPrep PCR purification kit
" (Bioneer, Genbiotech, Arg.)
Vector pGEM-T Easy (3000 pb)
T4 DNA Ligasa
4°C - ON
Relación molar inserto:vector:
C. albicans
4:1
S. aureus
2:1
E. coli
1:1
Vol. final = 10 μL
2 - Transformación células competentes por método shock térmico
One Shot
E. coli
top 10
+IPTG
+X-Gal

3- Minipreparación de DNA plasmídico
Punción de varias colonias blancas y una azul
3 placas:
V+I
C. albicans
(3600 pb)
V+I
S. aureus
(3350 pb)
V+I
E. coli
(3400 pb)
Extracción de plásmidos
4- Verificación clonado
EcoRI
37°C, 1h
Clonado correcto: Bacterias transformadas con fragmentos de interés para amplificación
in vivo
Esta tesina es parte de un proyecto para el diseño de un kit diagnóstico para la detección de septicemias a partir de botellas de hemocultivo
Aunque se utilizaron cultivos puros puede aplicarse a botellas de hemocultivo:
Sensibilidad alta
Detección amplio rango de agentes patógenos con alta especificidad
Disminución del t diagnóstico en al menos 40 hs
Costo de reactivos y equipamientos 90% menor que métodos comerciales actuales
Puede aplicarse en cualquier laboratorio con termociclador
Presentaciones en congresos nacionales
Diagnóstico microbiológico
Cada hora de retraso en la administración de una terapia antimicrobiana efectiva está asociada a un promedio del 8% de disminución de la sobrevida del paciente
90 seg
Infecciones del torrente sanguíneo
Variables metodológicas
Falsos +
Subunidad menor
16S 18S
INFECCIONES DEL TORRENTE SANGUÍNEO
SEPTICEMIA
SEPSIS
BACTERIEMIA / FUNGUEMIA
Evidencia clínica de infección
Estado inflamatorio generalizado = SRIS (Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica).
Infección sanguínea confirmada
Estado inflamatorio generalizado = SRIS (Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica).
Presencia confirmada de bacterias u hongos en sangre.
Pueden o no existir síntomas clínicos.
Componentes estructurales
ITS
Gran variabilidad entre especies
Oligonucleótidos específicos de especie
Búsqueda:
Hongos y levaduras: regiones 18S, 5.8S y 28S
Bacterias: regiones 16S, 23S y 5S
Se eligió trabajar con las regiones:
28S en hongos y levaduras

16S y 23S en bacterias
Poseen la mayor cantidad de zonas conservadas
DISEÑO DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOS
I - Entre secuencias de una misma sp
3- Alineamiento de secuencias nucleotídicas
Clustal W con BioEdit Sequence Alignment Editor v7.1.3.0
Elección de la secuencia a utilizar
OLIGONUCLEÓTIDOS PANFÚNGICOS (28S)

Directo
Reverso
D
R
D
R
D
R
PRUEBA DE LOS OLIGONUCLEÓTIDOS
DISEÑADOS Y ESTANDARIZACIÓN DE LAS REACCIONES DE PCR
OLIGONUCLEÓTIDOS PANBACTERIANOS G+ (16S)

Directo
Reverso
OLIGONUCLEÓTIDOS PANBACTERIANOS G- (16S)

Directo
Reverso
1 - Cultivo de mo
2 programas de amplificación (T y t de hibridación)

Universales
OLIGONUCLEÓTIDOS PANBACTERIANOS G- (23S)

Directo
Reverso
D
R
5 especies bacterianas G+:
2 enzimas termoestables
1 par oligonucleótidos (350 pb)


1 programa de amplificación

D
R
D
R
D
R
Se consiguió la estandarización de reacciones de PCR individuales que permiten identificar y diferenciar:
hongos
bacterias Gram positivas
bacterias Gram negativas
• En este trabajo se consiguió la estandarización y optimización de una matriz de reacciones de PCR utilizando ácidos nucleicos controles.
• Los oligonucleótidos panfúngicos y panbacterianos no presentaron reacciones cruzadas con el DNA de otros grupos.
• Este método permite detectar ADNdc con una sensibilidad de 740 UFC/mL para
C. albicans
, 3,3 x10^5 UFC/mL para
S. auereus
y 3,9 x10^6 UFC/mL para
E. coli
.
¡GRACIAS!
3 condiciones distintas
Full transcript