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Ivana Cavello

on 27 November 2014

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Universidad Nacional de La Plata

Facultad de Ciencias Exactas

Departamento de Química


Tesista: Cavello, Ivana
Director: Dr. Cavalitto, Sebastián
Año: 2013
Introducción General
Tesis Doctoral: "Queratinasas microbianas: microorganismos, caracterización y producción"
El siguiente trabajo de tesis consistió en el estudio de la producción, caracterización y aplicaciones de una enzima con actividad queratinolítica purificada de un hongo autóctono de la provincia de Buenos Aires
Argentina es un país que ha basado su economía principalmente en la agricultura y la ganadería. En el año 2012 el número de cabezas de ganado ascendía a 53 millones (vacuno, ovino, porcino, equino y caprino), de las cuales el 70% correspondía a ganado bovino, seguido por el 18% de ganado ovino, con una faena estimada en 4.75 millones de cabeza en los primeros 6 meses del mismo año.
Ligada a esta actividad ganadera se encuentran las curtiembres. Las cuales, junto con los frigoríficos, las empresas petroleras y de galvanoplastia representan uno de los sectores productivos más contaminantes del país.
Como alternativa al proceso de depilado convencional, donde el pelo es disuelto en sulfuro y cal, el proceso de depilado conservador del pelo tiene como beneficio hacia el medio ambiente una disminución de la contaminación en el efluente líquido de ribera. Sin embargo, como contraparte, durante este procedimiento se genera un nuevo residuo sólido llamado “residuo pelo”. El cual es separado del efluente líquido generalmente por filtración y dispuesto totalmente en rellenos sanitarios, generando serios problemas ambientales no sólo por el volumen generado diariamente sino también por su resistencia a la degradación.
El residuo pelo está compuesto en un 95% por queratina, proteína estructural, fibrosa e insoluble encontrada principalmente como componente de la piel y sus apéndices, cuya característica principal es su refractariedad a la degradación por proteasas comunes debido a su empaquetamiento compacto y a la presencia de puentes disulfuro inter e intramoleculares.
Sin embargo, a pesar de su naturaleza recalcitrante y la elevada resistencia a la degradación, las queratinas no se acumulan en la naturaleza, evidenciando de esta forma la existencia de microorganismos queratinolíticos capaces de degradar este material gracias a la capacidad que éstos tienen de producir enzimas proteolíticas específicas llamadas queratinasas.
En la cuenca hídrica Matanza-Riachuelo existen actualmente 196 curtiembres en actividad que procesan diariamente en promedio mil pieles cada una, llegando las más grandes a procesar 6 mil pieles diarias. Se estima que de un depilado conservador del pelo vacuno se recupera un 10% de pelo en estado húmedo. Lo que da una idea del volumen generado de este residuo diariamente y el problema ambiental que el mismo genera.
Dado que se trata de un residuo de naturaleza proteica, en este trabajo de tesis se planteó la posibilidad de considerar este residuo como materia prima sobre la cual ciertos microorganismos actuarían dando lugar a un residuo orgánico degradado y a un extracto proteico con actividad proteolítica de amplio espectro (queratinolítica).
Búsqueda de enzimas queratinolíticas producidas por hongos filamentosos
Ensayo cualitativo para evaluar la capacidad de las cepas de producir enzimas queratinolíticas extracelulares
Fermentación en sustrato sólido y en medio líquidos de las cepas seleccionadas para estudiar la producción cuantitativa de dichas enzimas
Ensayo cualitativo en placas de agar harina de plumas. A) A. murorum, B) C. cladosporoides, C) P. lilacinum, D) A. sidowii, E) N. tetrasperma y F) Westerdikella dispersa. A, B y C: cepas positivas con halo de hidrólisis alrededor de las colonias.
Estudio de la producción de enzimas queratinolíticas
Optimización de las condiciones de cultivo para la producción de las enzimas queratinolíticas
Optimización de los componentes del medio y de ciertos parámetros físicos utilizando la metodología de una variable a la vez (one variable at a time)
Identificación de los factores significativos mediante el diseño de Plackett-Burman
Diseño de superficie de respuesta compuesto central rotable
Producción de enzimas queratinolíticas por P. lilacinum
Efecto de la adición de diferentes agentes reductores al medio de cultivo
Efecto de la concentración de los iones metálicos presentes en el medio mineral base y de la adición de otras sales
Análisis de la represión catabólica por carbono
efecto de la suplementación con fuentes de nitrógeno exógenas
efecto del pH inicial
efecto de la concentración del inóculo sobre la producción enzimática
Metodología one variable at a time
Identificación de los factores significativos mediante el diseño de Plackett-Burman
El diseño de superficie de respuesta compuesto central rotable permitió mejorar la producción enzimática en 10.8 veces con respecto al valor original obtenido cuando el hongo se cultivaba en un medio mineral mínimo con sólo residuo pelo como fuente de carbono, nitrógeno y energía.
Gran estabilidad en un amplio rango de valores de pH y temperaturas.
Entre de los inhibidores de proteasas y metales estudiados, el PMSF y el cloruro de mercurio (II) inhiben la actividad proteolítica indicando la presencia de serin-proteasas tiol-dependientes.
Alta estabilidad frente a agentes tensioactivos, agentes blanqueadores, y solventes orgánicos.
Por medio de SDS-PAGE acoplado a zimograma se logró definir que el extracto enzimático estaba compuesto por dos proteasas, presentando solo una de ellas actividad queratinolítica.
SDS-PAGE acoplado a zimogramas con caseína y queratina soluble como sustratos. Calles 1 Marcador de bajo peso molecular; 2 extracto enzimático hervido y 3 sin hervir; 4 zimograma con caseína y 5 zimograma con queratina soluble
Purificación y caracterización de la queratinasa
La queratinasa logró ser purificada mediante una serie de pasos que incluyeron pasos de clarificación y concentración, seguidos de métodos cromatográficos.
El rendimiento total de proceso fue de 1.3 %, con un aumento de la actividad específica de 19.8 veces y una banda electroforéticamente homogénea de 37kDa,según el análisis por SDS-PAGE.
Por medio de la identificación mediante el uso de huellas peptídicas, comparando el extremo N-terminal así como también las características bioquímicas reportadas para distintos aislamientos de este microorganismo, se pudo demostrar que es una proteasa/queratinasa distinta a las que han sido reportadas hasta la fecha, compartiendo con algunas de ellas características bioquímicas y con otras características moleculares como la homología en los extremos N- y C-terminal.
La enzima resultó ser completamente estable en un rango de pH entre 4.0 y 9.0, por fuera de ese rango, resultó ser moderadamente estable, reteniendo un 50 % y un 40 % de su actividad enzimática a pH 3.0 y 12.0, respectivamente.
La queratinasa retuvo cerca del 90 % de la actividad luego de 3 h de incubación a 40 ºC y más de un 40 % de actividad a 50 ºC. A 65 ºC la enzima retiene sólo un 23 % de su actividad luego de 30 minutos de incubación.
Por su perfil de inhibición y teniendo en cuenta el efecto de algunos cationes sobre la actividad de esta enzima, se puede concluir que la queratinasa de P. lilacinum es una serin-proteasa tiol-dependiente, estable a solventes orgánicos, agentes oxidantes y detergentes.
Posee la capacidad de hidrolizar una amplia gama de sustratos relacionados con componentes de la piel, como el colágeno, la elastina y la queratina, así como también presenta la capacidad de hidrolizar albúmina y caseína.
Modelado cinético de la inactivación térmica
Inmovilización de la enzima sobre esferas de quitosan
Optimización de la activación de las esferas de quitosán
Medida de la actividad de la enzima inmovilizada sobre las esferas de quitosan
Caracterización de la enzima inmovilizada
a) estabilidad al pH y la temperatura
b) reutilización de la enzima en ciclos de hidrólisis en batch
c) estabilidad en el tiempo
Los resultados muestran que la enzima inmovilizada puede ser utilizada de forma repetida durante periodos prolongados de hidrólisis, reteniendo el 61% de su actividad inicial luego de 5 ciclos batch.
Luego de 7 días de almacenamiento a 4ºC ambas enzimas (libre e inmovilizadas) retuvieron más del 90 % de su actividad inicial.
Aplicaciones biotecnológicas del extracto enzimático
Evaluación del extracto enzimático como aditivo de detergentes comerciales y su eficacia en la remoción de manchas
Aplicación del extracto enzimático en la recuperación de plata a partir de la hidrólisis de placas radiográficas
Aplicación del hidrolizado como promotor de crecimiento vegetal
1. Estudio de la compatibilidad del extracto enzimático con detergentes comerciales
2. Estudio del efecto de agentes blanqueadores sobre la estabilidad enzimática
3. Eficacia de lavado

1. Evaluación de la capacidad de hidrólisis de la película de gelatina presente en las placas radiográficas
2. Optimización de la hidrólisis en términos de temperatura y cantidad de enzima
3. Evaluación de la capacidad de reuso del extracto enzimático en la hidrólisis de las placas radiográficas
4. Obtención de plata como cloruro de plata
1. Evaluación de la producción de ác. indolacético (AIA) por parte de P. lilacinum
2. Optimización de la producción de AIA
1. Ensayo de germinación de tomate platense italiano
2. Estudio del crecimiento de las plantas de tomate a escala de invernadero
3. Ensayo de biocontrol sobre diferentes hongos fitopatógenos
Ensayos invitro
Ensayos invivo
Con una concentración de Trp de 0.5 % p/v y de Fe+3 de 1.45 mg/l, al término de 8 días de cultivo se obtienen 13.5 ug/ml de aia, con un incremento de 5.8 veces con respecto a el cultivo en ausencia de Trp.
En cuanto a los hongos fitopatógenos Rhizoctonia solani, Trichoderma harzianum, Diaporthe spp. y Pythium ultimum se observó que en todos los casos el hidrolizado enzimático produjo un efecto fungistático del hongo patógeno, con un porcentaje de inhibición en el crecimiento micelial del 52 % para R. solani, del 69.4 % para T. harzianum, del 68 % para Diaporthe sp. y del 55 % para el caso de P. ultimum a las 44 h de incubación
El tratamiento de las semillas con el hidrolizado proteico incrementa el porcentaje de germinación con respecto al control
El efecto en el crecimiento de las plantas de tomate utilizando el hidrolizado proteico con alto contenido de AIA (5.5 ug/ml) y un contenido de nitrógeno de 430 ppm determinado como amoniaco, es comparable al obtenido con la solución de referencia (sol. de riego de Fähraeus) y puede ser utilizado como fertilizante orgánico.
Salvo para la cepa F. graminearum FUSKU # 117, todas las demás cepas patógenas lograron ser controladas por el extracto enzimático en un porcentaje mayor al 25 %, con una mayor reducción en la tasa de crecimiento de 2.5 a 1.1 cm/día para el caso de Trichoderma sp. y de 1.2 a 0.5 cm/día para A. alternata, respectivamente
Plantas de tomate platense italiano (Lycopersicum esculentum) creciendo a escala de invernadero en condiciones gnotobióticas (macetas con vermiculita estéril). Las plantas se rotaban de lugar cada 3 días. Se trabajo con fotoperíodos de 16 h a 26 ºC.
7 días del primer riego
16 días del primer riego
El presente trabajo de tesis doctoral permitió:

- plantear una alternativa a la disposición de un residuo sólido de curtiembre.

- reportar a la cepa Purpureocillium lilacinum LPSC # 876 -autóctona de la provincia de Buenos Aires- como un microorganismo con capacidad queratinolítica.

- reportar una serin-proteasa tiol-dependiente con actividad queratinolítica distinta a las reportadas hasta el momento por la misma especie.

- encontrar un modelo de cinética de inactivación térmica para la enzima distinto al de primer orden.

- inmovilizar a este nuevo catalizador biológico, aumentando su estabilidad a pHs extremos y altas temperaturas, planteando la posibilidad de su utilización en ciclos de hidrolisis consecutivos, así como también permitió plantear una alternativa menos tóxica en cuanto al agente entrecruzador a utilizar en la inmovilización.

- obtener un extracto proteico con actividad proteolítica que demostró ser potencialmente aplicable en la industria de los detergentes, en el reciclado de placas radiográficas para la obtención del plata y en la agricultura, pudiendo ser utilizado como fertilizante orgánico o como agente antagonista frente a fitopatógenos.

Gracias por su atención
7 días del riego
Caracterización bioquímica del extracto crudo
Medida de la actividad enzimática de ambos sistemas
Si bien el % de inmovilización obtenido fue mayor con glutaraldehído (96 ± 0.6 %), la actividad enzimática recuperada -la cual es proporcional a la pendiente de la recta- resultó ser menor que para el caso de la genipina, indicando que la enzima pierde parte mayor % de su actividad al usar glutaraldehído como entrecruzante.
Detergentes sólidos
Detergentes líquidos
Enzimas queratinolíticas

Son un grupo especial de proteasas que tienen la capacidad de degradar la queratina interviniendo en el proceso de queratinolisis.
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