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Cristalización de Eritrocruorina de Eisenia foetida

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by

Debir Davila

on 9 October 2014

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Transcript of Cristalización de Eritrocruorina de Eisenia foetida

Objetivo
El presente trabajo se realizó con el fin de obtener cristales de HbEf para obtener patrones de difracción que permitan construir su estructura 3D, tal que podamos comprender la función de esta proteína en la lombriz.

La HbEf, contenida en el filtrado, se purificó por cromatografía de exclusión molecular usando una columna Superdex 200 10/300 GL
¿Qué son las Eritrocruorina?
En muchos anélidos, el transporte de oxígeno está a cargo de proteínas extracelulares gigantes (~3,0 MDa - ~3,6 MDa), conocidas como eritrocruorinas, las cuales están formadas por 180 subunidades(Royer et al., 2006).

La HbEf tiene 180 cadenas polipeptídicas, de las cuales 144 subunidades formarían cuatro globinas diferentes, la unión entre éstas globinas va a constituir un cap y 36 subunidades formarían tres tipos diferentes de linkers, originando un heterotrímero.

HbEf es una proteína de gran tamaño, de naturaleza extracelular, resistente a la oxidación, y muestra una alta cooperatividad de unión por el oxígeno.

En las últimas décadas las eritrocruorinas despertaron mucho interés científico por su potencial uso como sangre artificial.

Las fracciones eluídas con color rojo (Vol 11, 12, 13, 14, 15 y 16ml) que contenían HbEf fueron cuantificadas a 280nm en un Nanodrop.
Las fracciones con gran cantidad de HbEf (Vol 12 (4.8mg/mL), 13(5.2mg/mL) y 14(1.9mg/mL)) fueron nuevamente concentradas hasta 1mL (30mg/mL) y mantenidas en refrigeración a 4°C.

Cristalización de Eritrocruorina de
Eisenia foetida

Métodos
Los especímenes de Eisenia foetida fueron colectados en el campo, transportados al laboratorio y lavados con agua potable.

La hemolinfa fue colectada en un deposito conteniendo 10 mL de buffer TRIS-HCl 100 mM pH 7,0 (Buffer A).

Luego se filtro con papel filtro para evitar algún tipo de contaminante sólido.
La cristalización se realizó con la técnica de difusión de vapor en gota pendiente, usando placas de cristalización CrystalQuick de 24 pozos y las soluciones de cristalización Grid Screens. 2,0 μL de solución de proteína + 2,0 μL de solución precipitante se colocaron en un cubreobjetos mientras que 300 μL de solución precipitante en los pozos de la placa.
Resultados

Purificamos eritrocruorina de Eisenia foetida mediante cromatografía de exclusión molecular.

Cristalización por vapor-difusión en gota pendiente. El recuadro muestra cristales de HbEf obtenidos en las condiciones: pH 7,0 y en presencia de sulfato de amonio en una concentración de 2,4 M.
Conclusiones
Purificamos eritrocruorina de Eisenia foetida mediante cromatografía de exclusión molecular.

HbEf se cristalizó en las condiciones: pH 7,0 y en presencia de sulfato de amonio en una concentración de 2.4 M, el tiempo de crecimiento de los cristales fue de aproximadamente 24 horas.

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