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Extracción de alfa-amilasa a partir de Aspergillus Niger.

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Gaby Garcia

on 22 October 2013

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Transcript of Extracción de alfa-amilasa a partir de Aspergillus Niger.

e) Prueba de Lugol para identificación de Aspergillus Niger. Se realiza la prueba de Lugol para saber donde había almidón. La técnica consiste en cubrir la caja Petri con Lugol cerca del mechero. Lo que se busca es aislar células degradadoras de almidón.
3.- Producción de enzima alfa-amilasa
a) Se prepara el medio de cultivo en base a los requerimientos y estabilidad de la enzima, suplementado con almidón (2.1%), KCl (0.17%), MgCl2 (0.2%) y aceite de soya (4.89%) para la producción óptima de la enzima.
1.-Obtención del hongo Aspergillus Niger.
a) Se tiene el hongo aspergillus niger ya cultivado en una caja Petri, el cual provenía de tierra o lodo.
2.- Resiembra del Hongo en el medio de cultivo

a) Preparacion del medio Agar Papa Dextrosa (PDA): Disolver 35g/l de PDA en agua destilada. Ajustar el pH a 5.6 con una solucion de HCL 0.1 N o de NaOH a 0.1 N. Esterilizar a 121°C durante 15 minutos. Sacar de la autoclave y repetir en las cajas petri. Colocarlos en posición inclinada para generar una amplia superficie cuando el agar solidifique.




Extracción de alfa-amilasa a partir de Aspergillus Niger.
b) Se deja fermentar durante 6 días a una temperatura de 28°C.

b) Hongos: Se colocan 3-4 cajas con agar PDA con 5g/L de fécula de maíz.

c) Siembra por estriado en placa: con una asa bacteriológica estéril se pasa una porción de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio por cuadrantes, y se desliza en zigzag.
d) Se deja incubar a temperatura ambiente durante 3 días.
4.- Extracción de la enzima
a) Para la fermentación, las esporas de las cepas detectadas se suspenden en Tween- 80 al 0.01% y se llevan al cultivo sobre salvado de trigo estéril (121 °C durante 15 minutos). Se deja en fermentación durante 7 días a 28 °C.
b) Las enzimas extracelulares, luego de la fermentación en fase sólida. Se extraen con solución 1% de NaCl, en una relación 50ml / 100g de salvado. Mediante agitación durante 30 minutos y posterior filtración.
5) Medición de la actividad enzimática.

a) Se usa almidón soluble como sustrato. Se emplea una solución tamponada (0.05% almidón, NaCl 0.15 M, CH3COONa 0.1 M, en un PH de 5).

b) La reacción enzimática consiste en poner 10 microlitros de extracto enzimático junto con 0.5 ml de solución de sustrato, incubando a 37 °C durante 10 minutos.


c) Se cuantifica la reacción mediante espectrofotometría a 575 nm, utilizando una curva patrón de la solución de glucosa
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