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preparacion de expandidos y metodos de tincion

expo final tincion
by

andres gomez

on 8 April 2012

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Transcript of preparacion de expandidos y metodos de tincion

PREPARACIÓN DE EXTENDIDOS Y METODOS DE TINCION Correa, M. 0938357 Gomez, A. 0923834 Extensión: se realiza sobre un portaobjetos que ha de estar totalmente limpio. Si la muestra es líquida se hace directamente y si es sólida, hay que resuspenderla previamente en una gota de H2O. de éste depende de la efectividad con el que el tinte colore, y la posibilidad de visualización en el microscopio

Fijación: tiene por objeto adherir la muestra al portaobjetos y desnaturalizar las proteínas para facilitar la acción del colorante. Normalmente se realiza con calor, pasando la muestra repetidamente a 10 cm de la llama del mechero. O cubriendo la preparación con etanol y metanol Se deja actuar durante varios minutos se escurre y se deja secar

Tinción: se realiza añadiendo los colorantes sobre los microorganismos sometidos a los procesos anteriores (1). Extendido en placa Adicionar una gota de agua en el portaobejto. Estirilizar el asa en el mechero Enfriar el asa en el borde del medio y tomar una muestra Diluir la muestra en la gota de agua en el portaobjetos. Extender la muestra diluida en el portaobjeto. Dejar secar la muestra y fijarla pasandola por llama del mechero dos veces Resultados Coloración Negativa 400 X La tinta china es una suspensión de partículas de carbono coloidal, estas tiñen el medio extracelular, permitiendo observar la presencia de capsulas; esto se genera debido a que las partículas de carbono tienen carga negativa al igual que la pared celular bacteriana generando un estado de repulsión de cargas (2). Klebsiella Forma: Bacilococo

Distribución: Esparacidas

Coloración de Gram Bacteria Gram positiva Staphylococcus aureus
Forma: coco
Distribución: Agrupados con espacios entre grupos.
Coloración: Violeta.

Coloración de Gram Bacteria Gram negativa 400X 400X Escherichia coli
Forma: Bacilo
Distribución: Agrupados con espacios entre grupos.
Coloración: Rosada


400X Etapas en la tinción de Gram Tabla N°1Efecto Alcohol acetona en la tinción de Gram solución de Yodo Clasificación Bacterias Reactivos Tinción de Gram COLORACIÓN DE CÁPSULA (método de Anthony) forma: Bacilos

Distribución: heterogénea

Coloración: Hialina pero por el contraste se observaron de color morado

La tinción no se realizó en la cápsula, lo que se obtuvó fue un contraste de fondo, para ver el espacio incoloro que vendría siendo la cápsula no coloreada UN MÉTODO EFICIENTE PARA AUMENTAR EL CONTENIDO CAPSULAR ES A TRAVÉS DEL AISLAMIENTO DEL MATERIAL CAPSULAR:

• El material de las capas mucosas (cápsulas flexibles y periféricas) es mas fácil de aislar, ya que tiende a dispersarse continuamente en el medio de cultivo. Por lo tanto, se puede aislar directamente de los sobrenadantes resultantes de la centrifugación del cultivo correspondiente.

• El material de las cápsulas rígidas e integrales puede aislarse tratando al cultivo con agua caliente o con ácidos o álcalis débiles (4)

PRESENCIA DE LA CAPSULA CON LA VIRULENCIA DE UNA BACTERIA PATOGÉNICA Muchas cápsulas polisacarídicas no son reconocidas como material extraño por el sistema inmune, debido a que su estructura “mimetiza” estructuras del propio hospedador. Otras sobrepasan la capacidad de respuesta del sistema inmune, o bien no activan eficientemente al sistema, por esto la capsula se convierte en un factor del cual depende el inicio de las infecciones bacterianas (4). Cristal violeta y el sulfato para la coloración de capsula Estos reactivos se emplean mediante soluciónes acuosas de cristal violeta 1% y 2% sulfato de cobre.Las cápsulas se visualizaran de azul pálido y las bacterias de color púrpura y el fondo claro, el sulfato de cobre imparte color al fondo y esto resulta en que la célula y el fondo aparezcan teñido de un color diferente al de la capsula (4). COLORACIÓN DE ESPORAS

400x Bacillus cereus Forma: Bacilo
Distribución: agrupada en diferentes partes de la placa
Coloración: verde (endoespora) rosada (bacteria) Las esporas se observan verdes , estas pueden estar en el interior de la pared bacteriana o puede deformar la pared, ya que al crecer aumentan el tamaño celular, y en algunos casos pueden hacerla estallar Tinción de Esporas Las endosporas son más difíciles de teñir que una célula vegetativa, esto se debe a que las esporas poseen una pared muy gruesa junto con cubiertas exclusivas (calcio y ácido dipicolínico) que las hacen resistentes a los factores ambientales adversos como el calor, mientras que las células vegetativas tienen pared gruesa, pero no son tan resistentes a los factores externos (1).

Verde malaquita: capaz de teñir las esporas en caliente Cristal violeta de contraste que tiñe las formas vegetativas.
Prueba de KOH El fundamento de esta prueba radica en diferencias químicas de la pared celular bacteriana. La pared celular Gram-negativas es fácilmente alterada por soluciones alcalinas. El rompimiento de la pared celular hace que la suspensión de KOH se vuelve viscosa debido a la liberación de las partes relativamente poco fragmentadas del ácido desoxirribonucleico. Mientras en las Gram positivas este reactivo no presenta ningún efecto(2). Tabla N°2 Ventajas y desventajas en la prueba de KOH Prueba motilidad Tabla N°3 Pruebas para motilidad bacteriana Colorantes fluorescentes y su función:

Son pigmentos orgánicos luminiscentes que al ser excitado con la luz ultravioleta emite una fluorescencia verde amarillenta esta técnica se implementa ecología microbiana para la identificación directa de células microbianas en ambientes naturales, o como medio para su conteo y observación en diferentes muestras (2).

Tinción filogenética

Permite la detección, enumeración o localización filogenética y biodiversidad de los diferentes grupos microbianos, e incluso su taxonomía mediante la utilización de isótopos radiactivos y tinciones fluorescente; el primer método emplea sondas marcadas, que se agregan a células fijadas, que se fijan a un ribosoma. El marcado de las células se verifica haciendo una radiografía (exposición de una emulsión fotosensible a la radiactividad de los ribosomas) (2)

Existen diferentes métodos de tinción que facilitan la observación y la clasificación bacteriana a partir de su morfología, estos se basan en la composición bacteriana para colorear determinadas estructuras.

Para la identificación morfológica por tinción de bacterias es de suma importancia realizar los procesos de extendido y fijación, de estos depende que la coloración que se vaya a realizar sea adecuada.

La diferenciación entre Gram positivas y Gram negativas se genera a partir de la coloración que estas desarrollen y esta dependerá de la diferencia constitutiva en la estructura de la pared celular de las bacterias.

La prueba de KOH a pesar de ser un método menos complejo que la tinción de Gram no muestra los mismos resultados, en esta prueba no se pueden obtener observaciones de tipo morfológico que son claves en el estudio microbiológico.

Las tinciones diferenciales reaccionan dependiendo el tipo de bacteria, estos métodos son de gran utilidad para establecer diferencias entre distintos grupos bacterianos.

La tinción de la capsula bacteriana es un método complejo como consecuencia que esta estructura posee materiales hidrosolubles que pueden desprenderse durante un lavado riguroso, para realizar la coloración de estas estructuras es necesario implementar compuestos coloidales como la tinta china, estos generan tiñen el medio y no la bacteria.

Conclusiones 1. Gamozo. C., Lopez-Goñi. I., Díaz. R. 2005 Manual práctico de microbiología. Tercera edición. Editorial masson

2. Gerard, J. Tortora, B., R. Funke, C., L. Case. 2007. Introducción a la Microbiología. Editorial Médica Panamericana. 959 pp.

3. Halebian, S., Harris, B., Finegold, S. M., y Rolfei R. D. 1981. Rapid Method That Aids in Distinguishing Gram-Positive from Gram-Negative Anaerobic Bacteria. Journal Of Clinical Microbiology. 444-448 pp.

4. Koneman E. W. 2006. Diagnostico microbiológico. 6ta edición. Editorial medica Panamericana. USA. 1696 pp

Bibliografía Motilidad bacteriana Proteus
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