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Untitled Prezi

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Ana Elisa Longo

on 1 August 2013

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Ginogênese em Cebola e Androgênese com Avaliação de Progênies de Autofecundação em Couve-flor
Ginogênese em Cebola e Androgênese com Avaliação de Progênies de Autofecundação em Couve-flor
CEBOLA E COUVE-FLOR
INTRODUÇÃO
GINOGÊNESE EM CEBOLA
OBJETIVO GERAL
Obter plantas haploides e/ou duplo-haploides in vitro, por meio de ginogênese de cebola e androgênese de couve-flor.
Orientador: Dr. Carlos Augusto Colombo
Co-Orientador: Dr. Walter José Siqueira
Doutoranda: Ana Elisa de Oliveira e Longo


GENÉTICA, MELHORAMENTO VEGETAL E BIOTECNOLOGIA

Ferramentas biotecnológicas

Indução de duplo-haploides in vitro

Acelerar - produção de linhas homozigotas

Interesse - produção comercial de híbridos F1

Vantagens - reduz o tempo na obtenção de cultivares

Trabalho pioneiro no Brasil

INTRODUÇÃO
CAMPION et al. (1984) falharam na tentativa de induzir androgênese;
Iniciaram experimentos de ginogênese in vitro;
MUREN (1989) - 1º protocolo com sucesso;

Várias adaptações utilizando-se:
óvulos (CAMPION et al., 1992);
ovários (KELLER, 1990; JAKŠE et al., 1996);
botões florais (SMITH et al., 1991; BOHANEC, 1999; GEOFFRIAU et al., 2006).

LONGO (2009)
Início: botões florais,
Melhores resultados: óvulos.

ANDROGÊNESE EM COUVE-FLOR
INTRODUÇÃO
Cultura de anteras em várias espécies do grupo das Brássicas;

Exemplos: couves, brócolis e couve-flor (KELLER OCKENDON 1988).

KELLER et al. (1975) – 1º com sucesso brócolis;

OCKENDON (1988) – 1º com sucesso em couve-flor;

DIAS (1999); DIAS & MARTINS (1999); ACHAR (2002) – modificações do meio de KELLER et al. (1975).

OBJETIVOS
MATERIAL E MÉTODOS
MATERIAL VEGETAL
CEBOLA
Populações de
Baia e Crioula
MATERIAL VEGETAL
COUVE-FLOR
Populações em F1, F2, F3 e F5
MÉTODOS
Ginogênese de Cebola
escuro
MATERIAL E MÉTODOS
Couve-flor - Avaliação aos 30 dias: crescimento de calos
Cebola - Avaliação aos 90 dias: crescimento de óvulos
Notas de 1 a 4 sendo:
1. ausência de crescimento;
2. início de crescimento até 1/3;
3. entre 1/3 e 2/3 e
4. dobro de crescimento.

Programa SANEST
ANAVA
Teste de Tukey a 5%.


Análise Estatística: Cebola e Couve-flor
Identificação e correlação entre a fase do micrósporo e o tamanho do botão floral
Pré-tratamento de frio (0 e 7 dias a 4°C) +:
Botões florais entre 0,5 a 4 mm
MÉTODOS
COUVE-FLOR
MÉTODOS
Androgênese de couve-flor: estresses
Tratamento com altas temperaturas
MÉTODOS
Androgênese de couve-flor: estresses
Pré-taratmento de frio: pelo menos um dia a 4°C +:
MÉTODOS
Ginogênese de Cebola: meios de cultura
2009 e 2010:
MI1: B-5 + 2,0 mg/l de 2,4-D; 2,0 mg/l de 6-BA, 100 g/l de sacarose e 2 g/l de carvão ativado e

MI2: B-5+ 4,0 mg/l de 2,4-D; 4,0 mg/l de 6-BA, dobro de vitaminas e 2 g/l de carvão ativado.

2011 e 2012: só MI2
MI1: B-5 + 1,0 mg/l de 2,4-D; 1,0 mg/l de NAA, 100 g/l de sacarose, 800 mg/l de glutamina, 100 mg/l de serina, 5,8 g/l de ágar (CONTROLE) (2009, 2010, 2011 e 2012).

Variações:
MI2 = MI1 + 1,0 g/l de carvão ativado (2009);
MI3 = MI1 + 10,0 mg/l de AgNO3 (2009, 2010, 2011 e 2012);
MI4 = MI3 + 1,0 g/l de carvão ativado (2009);
MI5 = MI1 + 1,0 mg/l de 2,4-D + 1,0 mg/l de NAA (2010) e
MI6 = MI1 + 25,0 mg/l de AgNO3 (2010, 2011 e 2012).

MÉTODOS
Androgênese de couve-flor: meio de cultura
MÉTODOS
ANDROGÊNESE DE COUVE-FLOR
2010, 2011 e 2012
Plantas aclimatizadas de cebola e couve-flor foram avaliadas por citometria de fluxo quanto à ploidia (n, 2n ou 4n)
CEBOLA
Planta haploide:
Bulbificou
Passou por clonagem através de fasciculação do disco basal
Plantas clonadas passaram por duplicação cromossômica in vitro com 10 mg/l de colchicina por 24h
COUVE-FLOR
Análise com Isoenzimas
Couve-flor

AVALIAÇÃO QUANTITATIVA

SCOTT & KNOTT: progênies + pais – Programa GENES
Teste de Dunnet: progênie comparada com pai – programa SANEST

Estimativas de parâmetros genéticos (sem os pais):
h2,
Ganhos genéticos (%),
Correlações: genéticas, fenotípicas e de ambiente


Couve-flor

DBC
4 blocos, com 4 controles (plantas irmãs da doadora) e 18 progênies em cada bloco,

10 plantas por progênie e controle. Total = 880 plantas.


AVALIAÇÃO QUALITATIVA

Notas por progênie, uniformidade e vigor (média de 4 avaliadores)
Teste de Dunnet - Programa SANEST.






Couve-flor

Medidas quantitativas
MÉTODOS
CEBOLA E COUVE-FLOR
MÉTODOS
MÉTODOS
MÉTODOS
Diferenciar plantas homozigotas das heterozigotas

Progênies de Autofecundação
MÉTODOS
Progênies de Autofecundação
MÉTODOS
RESULTADOS
CEBOLA
RESULTADOS
CEBOLA
MÉTODOS
COUVE-FLOR: análise com SSRs
264 amostras
MÉTODOS
COUVE-FLOR: SSRs
Extração de DNA: método de CTAB
Quantificação de DNA e montagem dos 22 BULKS: 18 progênies S e 4 controles, cada bulk com 12 indivíduos
Reações de PCR: 11 primers
Eletroforese em gel Agarose low Melting 4%

1 Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5%. Meios - MI1: B-5 modificado com 2,0 mg.L-1 de 2,4-D e 2,0 mg.L-1 de 6-BA, contendo 100 g.L-1 de sacarose, 5,8 g.L-1 de ágar e 2 g.L-1 de carvão ativado; MI2: mesmo meio descrito anteriormente (MI1) com o dobro da concentração dos reguladores de crescimento e das vitaminas (4,0 mg.L-1 de 2,4-D; 4,0 mg.L-1 de 6-BA; 2 g.L-1 de tiamina; 200 mg.L-1 de piridoxina; 200 mg.L-1 de ácido nicotínico e 200 mg.L-1 de myo-inositol).

Teste de Tukey para médias de crescimento de óvulos de cebola inoculados em para dois meios (MI1 e MI2) de indução de ginogênese. Campinas, SP, 2009 e 2010.

1 Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5%. Estádio de desenvolvimento de botão floral - grandes (0,018 g e/ou ≥ 5 mm), médios (0,014 g e/ou ≥ 4 mm) e pequenos (0,012 g e/ou ≥ 3 mm).

Efeito do estádio de desenvolvimento do botão floral de cebola para crescimento de óvulos na indução de ginogênese. Campinas, SP, 2009, 2010, 2011 e 2012.

2009
2011
haploide
mixoploide
2010 Ápos tratamento com colchicina
Tratadas
Controle
haploide
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
COUVE-FLOR

Avaliação: notas de calos
Escuro: 30 dias
1 dia 35°C +
1 dia 30°C +
25°C continuamente
Desinfestação
2% - 20min
1 dia 4ºC
1-2 mm
Placa de Petri
15 anteras
Androgênese in vitro em couve-flor
30 dias
Estufa
Aclimatização
Placa de Petri
Regeneração via calo: couve-flor
luz
ESTUFAS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
IAC
SAKATA
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5%; Meios - MI1 (controle): B-5 com 1,0 mg.L-1 de 2,4-D e 1,0 mg.L-1 de NAA, contendo 100 g.L-1 de sacarose, 800 mg.L-1 de glutamina, 100 mg.L-1 de serina e 6 g.L-1 de ágar; MI2 = MI1 + 1,0 g de carvão ativado; MI3 = MI1 + 10,0 mg.L-1 de AgNO3; MI4 = MI3 + 1,0 g de carvão ativado; MI5 = MI1 + 2,0 mg.L-1 de 2,4-D + 2,0 mg.L-1 de NAA; MI6 = MI1 + 25,0 mg.L-1 de AgNO3.

Médias de crescimento de calos de couve-flor formados via androgênese para todos os meios de indução testados. Campinas, SP, 2009, 2010, 2011 e 2012.

RESULTADOS
1Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 5%; Meios - MI1 (controle): B-5 com 1,0 mg.L-1 de 2,4-D e 1,0 mg.L-1 de NAA, contendo 100 g.L-1 de sacarose, 800 mg.L-1 de glutamina, 100 mg.L-1 de serina e 6 g.L-1 de ágar; MI3 = MI1 + 10,0 mg.L-1 de AgNO3.

Médias de crescimento de calos de couve-flor formados via androgênese (meios testados MI1 e MI3). Campinas, SP, 2009; 2010; 2011; 2012.
Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de Tukey a 1%; Explante (antera cortada ao meio): parte basal (de onde o filete foi retirado), parte distal (sem filete).

Médias das partes das anteras (basal e distal) de crescimento de calos de couve-flor formados via androgênese. Campinas, SP, 2010, 2011 e 2012.
Resultados da análise de ploidia (citometria de fluxo) das plantas de couve-flor regeneradas via androgênese e posteriormente aclimatizadas. Campinas, SP, 2009, 2010 e 2011.
Resultados da análise com isoenzimas das plantas de couve-flor regeneradas via androgênese e aclimatizadas. Campinas, SP, 2009 e 2010.
Descrição das plantas de couve-flor regeneradas via androgênese, autofecundadas, que originaram as Progênies S. Bragança Paulista, SP, 2012.
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
Autofecundação
RESULTADOS
Plântulas
Avaliação qualitativa: Notas por progênie, uniformidade e vigor – Teste de Dunnet
Avaliação Quantitativa
Avaliação de cabeças em ponto de colheita
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
Análise de 10 caracteres
Possíveis indicadores de poliploides que apresentam variação no genoma expressa no fenótipo
IF- folhas arredondadas (> 0,5)= poliploides
folhas alongadas = DH
CF = > ploidia < CF

2 Caracteres avaliados durante a fase vegetativa: UNIFORMIDADE eVIGOR e 8 caracteres avaliados durante a fase de "cabeça comercial":
QMP: quadrado médio da progênie; VarP: variância da progênie; VarE: variância do ambiente; CVE%: coeficiente de variância ambiental; CVG%: coeficiente de variância genética; b: relação entre CVG% e CVE%; h2: herdabilidade; p: seleção em um sexo; k: intensidade de seleção; Gs: ganho de seleção relativo. DC: diâmetro de cabeça; IF: índice de formato; CF: comprimento foliar; DP: diâmetro da planta; AP: altura da planta; %DF: porcentagem de defeito; %OF: porcentagem de “off type”; UNF: uniformidade; VIG: vigor; %PC: porcentagem de cabeças comerciais.

Estimativas de parâmetros genéticos de caracteres vegetativos e reprodutivos das Progênies S. Bragança Paulista, 2012.
DC: diâmetro de cabeça; IF: índice de formato; CF: comprimento foliar; DP: diâmetro da planta; AP: altura da planta; %DF: porcentagem de defeito; %OF: porcentagem de “off type”; UNF: uniformidade; VIG: vigor; %PC: porcentagem de cabeças comerciais.

Estimativas das correlações fenotípicas (rF), genética aditiva (rA) e ambiental (rE), entre os caracteres vegetativos e reprodutivos das Progênies S. Bragança Paulisa, SP, 2012.

RESULTADOS
RESULTADOS
SSRs
CONCLUSÕES
Estufa

Análises
Molecular SSRs e
Ploidia "off type"
Plantas regeneradas

Progênies S1 de planta regenerada

Avaliação qualitativa

Avaliação Quantitativa,

sementes

Autofecundação

Análises
Ploidia e
Isoenzimas
MÉTODOS
COUVE-FLOR
Plantas das Progênies S consideradas off type. Última foto à direita, planta normal. Bragança Paulista, SP, 2012.

Identificação das plantas regeneradas via androgênese que deram origem as Progênies S, após as análises de ploidia, de isoenzimas e com marcador SSR. Campinas, SP, 2012.
Tanto a ginogênese em cebola como a androgênese em couve-flor são viáveis para obtenção de plantas duplo-haploides.

Em cebola, o meio de indução para ginogênese deve conter reguladores de crescimento e vitaminas em elevadas concentrações.
Óvulos como explantes para ginogênese em cebola foram mais eficientes.

Em couve-flor a fase de micrósporo da antera é a ideal para indução de androgênese.
São necessários pré-tratamentos com baixas temperaturas combinados com altas temperaturas para indução da androgênese.
O meio de indução para androgênese deve conter nitrato de prata.
Plantas regeneradas diploides devem ser avaliadas como homozigotas ou heterozigotas.

Nas Progênies S foram identificadas plantas com características desejáveis de planta e inflorescência (cabeça), além de plantas com variação somaclonal.

PR = Planta regenerada via androgênese de couve-flor; Mixo = mixoploide.
Ploidia das Progênies S e Controle consideradas off type. Campinas, SP, 2012.
RESULTADOS
RESULTADOS
RESULTADOS
"OFF TYPE"
11 primers
1 não amplificou
9 homozigotos para todas as amostras
1 polimórfico

CONTROLE
C1
C2
C3
C4
P1
PROGÊNIES
P3
P4
P9
P12
RESULTADOS
INTRODUÇÃO
AaBbCcDd
ABCD
abcd
AABBCCDD
aabbccdd
INTRODUÇÃO
CEBOLA E COUVE-FLOR
Plantas alógamas

Alto grau de heterozigose - AaBbCcdd

Híbrido F1:
Cruzar linhagens contrastantes AAbbCCDd X aaBBccDd
Heterose - AaBbCcDd
Vários ciclos de autofecundação
Barreiras para autofecundação

2n
n
2n
100% homozigota
Duplo-haploides
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