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La señalización de GLUT4 estimulada por insulina es mediada

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Alejandro Barboza

on 29 April 2015

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Transcript of La señalización de GLUT4 estimulada por insulina es mediada

Fig3: La microinyección de T24 Ras induce la expresión de la proteina c-Fos pero no la translocación de GLUT4.
Vías de señalización de la insulina
Cultivo celular y microinyección
Se cultivaron adipocitos 3t3-L1 en un medio alto en glucosa que contenia penicilina, estreptomicina y SFC en un ambiente con 10% de CO2.
Se las dejo crecer durante 2 días y luego se las diferencio mediante la adición al medio de isobutilmetilxantina, dexametasona e insulina por 3 días.
Al cabo de 10 días las células estabas totalmente diferenciadas
Introducción:
La insulina es una hormona sintetizada por las células B del páncreas.
Uno de sus efectos fisiológicos de mayor relevancia es la regulación de los niveles plasmáticos de glucosa.
Este efecto lo logra mediante la translocación del transportador GLUT4 sensible a la insulina.
Esta respuesta esta mediada por un camino de señalización metabólica que diverge del mitogénico.
Defectos en el camino de señalización metabólica y/o la disminución de transportadores GLUT4 estimulados por la insulina causa enfermedades tales como: DM1, obesidad y síndrome de ovario poliquístico.
Mediante microinyección en adipocitos 3t3-L1 y detección de GLUT4 por inmunofluorescencia se pudo determinar que la inhibición de p21ras endógena o la inyección de P21ras ontogénica no tiene efecto en la translocación de GLUT4 . Sin embargo la microinyección de anticuerpos anti-fosfotirosina o la inhibición de la PI3-K endógena inhiben marcadamente el efecto biológico de la insulina.
Inmunotinción y microscopia de fluorescencia
Adipocitos 3t3-L1 fueron estimulados con insulina por 20 minutos y luego fijadas en formaldehído en PBS .
Posteriormente fueron lavadas, bloquedas con triton en PBS durante 10 minutos.
Luego fueron incubadas a 4°C con anticuerpos de conejo anti-GLUT4.
Se realizo tinción para GLUT4 y se determino mediante incubación con IgG anti conejo e IgG anti oveja conjugada con AMCA cuales células fueron microinyectadas.

Vías de señalización de la insulina
Procedimiento:

Se microinyectaron adipocitos 3T3-L1 con diferentes reactivos y anticuerpos:
IgG(control)
p21Ras( anticuerpo)
N17 Ras (inhibidor domiante)
T24 Ras
Anti - Shc (anticuerpo).
Posteriormente los adipocitos fueron estimulados en presencia o en ausencia de insulina y teñidos para su evaluacion mediante inmunofluorescencia.
Fig1: Visualización de la translocación de GLUT4 en adipocitos 3T3-L1 estimulada por insulina.
Fig2: Efecto de la microinyeccion de Ras N17, ac anti-p21ras, T24 Ras y ac anti-sh sobre la translocación de GLUT4 en los adipocitos 3T3-L1.
Conclusiones:
La vía de p21Ras, componente crítico en la vía de señalización mitogénica, no es necesario para la translocación de GLUT4 estimulada por la insulina.
Esto proporciona una clara evidencia de la divergencia entre señales metabólicas y mitogénicas.
La PI3-K es una molécula de acoplamiento necesaria, activada por la señal de fosforilación de tirosina generada por el receptor de Insulina, que media el transporte de glucosa mediante la translocación de GLUT4.
La señalización de GLUT4 estimulada por insulina es mediada por un camino de señalización intracelular divergente.
A: sin insulina.
B: con insulina.
AyE:contraste de fase.
B y F: tinción de IgG, demostrando celulas inyectadas.
AyE: contraste
de fase.
ByF:tinción de IgG,
demostrando cel
inyectadas.
CyG:tinción de c-Fos.
DyH: tinción de GLUT4.
Fig4: Inhibición de la translocación de GLUT4 por microinyección de la proteina de fusión GST-p85 o el anticuerpo fosfotirosina.
GRACIAS!!!
Jimena González.
Keshia Mcab.
María Laura Ramos.
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