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TESIS

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by

Veronica Braida

on 22 August 2016

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Transcript of TESIS

Aislamiento en medio sólido
Agar 15 g/L
24 h Luz, 24-26 °C
0,80
0,43
- Evita el gasto energético del secado de biomasa
- Reduce contaminantes como la clorofila - mayor vida útil del aceite.
- Utiliza porcentaje bajos de solventes orgánicos
- Permite el fácil escalado a nivel industrial
Producción de biodiesel
Cosecha biomasa
Secado
Extracción de lípidos
Conversión a biodiesel
Aplicaciones del cultivo de microalgas en arquitectura sustentable
¿Qué son las microalgas?
Las algas y el biodiesel
Bioelectricidad
Celdas de combustible microbianas fotosintéticas de algas


Resultados y discusión
Introducción
Aplicaciones








1. Generar una colección de microalgas de agua dulce a partir de muestras tomadas dentro del territorio nacional.
2. Poner a punto metodologías de cultivo de microalgas.
3. Evaluar la extracción de lípidos por vía húmeda y estudiar la productividad lipídica de diferentes cepas de microalgas.
4. Analizar diferentes pretratamientos de biomasa de microalgas para la producción de bioetanol.
5. Diseñar y construir celdas de combustible microbianas fotosintéticas para evaluar la actividad bioeléctrica de cultivos de microalgas.
6. Diseñar y construir un fotobiorreactor de placa plana a escala laboratorio para el crecimiento de microalgas
7. Determinar la productividad de diferentes cepas en el reactor de placa plana a escala laboratorio en comparación con un reactor tubular.
8. Diseñar y construir un fotobiorreactor de placa plana a escala piloto para su posterior instalación en una escuela.



Verónica Braida - María Pía Campot - Eliana Nervi - Carolina Tartaglia
Tutor: MSc. Rodrigo Achigar
Las microalgas son capaces de
potenciar
la producción de electricidad formando parte de la cámara catódica en una MFC.
Celdas de combustible microbianas



ENERGÍA
Sustrato biodegradable

ELECTRICIDAD
(MFC)
¿Cuál es el rol de las microalgas?
Objetivo general
Objetivos específicos
Ventajas de microalgas:
Eficiencia fotosintética
Rápido crecimiento
Tierras no cultivables
Producción no estacional
Reciclar CO
Acumulan y sintetizan lípidos
Contienen carbohidratos
Ventajas
Curva peso seco en función de peso húmedo de
Choricystis minor.
Resultado de la extracción de lípidos para las cepas ensayadas.
Conclusiones
TLC de doble desarrollo en silica gel. Las muestras sembradas de izquierda a derecha corresponden a
Raphidocelis subcapitata
(R),
Monoraphidium sp.
(M), Estándar (St), (C)
Choricystis minor
y (S)
Scenedesmus armatus.
Las cepas mas prometedoras para la extracción de lípidos de microalgas son
Choricystis minor
y
Scenedesmus armatu
s
ya que presentaron los mayores porcentajes lipídicos (60-70 %)
Se encontraron a los
triglicéridos
como componente principal del aceite de las microalgas.
Actividad bioeléctrica de las microalgas
Acciones futuras
Ensayo en celdas de una cámara en 50 mL. Seguimiento de voltaje en función del tiempo.
Espectro de absorción de la clorofila entre 300-700 nm en la última fracción de la extracción.
Fuente: Loera-Quezada MM, Olguín EJ. Las microalgas oleaginosas como fuente de biodiesel: retos y oportunidades. 2010. Rev Latinoam Biotecnol Amb Algal; 1: 91-116.
Diseño y construcción de celdas
Representación esquemática de las celdas de una y dos cámara en las diferentes configuraciones ensayadas.
Generar una colección de microalgas de agua dulce, evaluar aplicaciones biotecnológicas de las mismas y diseñar un fotobiorreactor de placa plana a escala piloto para el cultivo de microalgas, a ser instalado en el establecimiento escolar "Una escuela diferente".
"Una Escuela Diferente"
1ra escuela autosustentable de Latinoamérica.
Autoabastecimiento de agua, electricidad, calefacción y alimentos orgánicos.
Sistemas de cultivo de microalgas
Aislamiento y caracterización

Diseño y construcción de un fotobiorreactor de placa plana a escala de laboratorio
Aislamiento
Caracterización
Parámetros de crecimiento
Abiertos
Cerrados
iluminación - pH - carbono - temperatura - salinidad - oxígeno - agitación - concentración celular
1. Métodos nutricionales de enriquecimiento.
2. Métodos de manipulación mecánica.
3. Técnicas que implican el uso de antibióticos.
¿Cómo?
¿Por qué?
Esencial para el estudio de la fisiología, la bioquímica, y la biología celular de las microalgas, así como también para estudios en genética molecular.
a) Morfológica -
b) Molecular -
Tarea difícil ya que se carece de marcadores morfológicos lo suficientemente precisos para la identificación.
Identificación por secuencias codificantes para ARNr 18S. Técnica rápida y exacta.
Fuente: http://www.farodevigo.es/gran-vigo/2012/08/05/expertos-campus-cultivan-microalgas-biodiesel-planta-pionera-tui/671513.html
Fuente:http://www.visionmaritima.com.uy/vision-maritima/index.php/educacion-y-ciencia/2890-nasa-quiere-crear-granjas-flotantes-de-microalgas
- Fáciles de construir y operar.
- Limitaciones: pérdidas por evaporación.
mínimo aprovechamiento de la luz.
difusión del CO a la atmósfera.
requieren grandes superficies de tierra.

-
Fotobiorreactor:
recipiente de cultivo cerrado e iluminado.
- No poseen intercambio directo de gases ni contaminantes con el ambiente.
- Ofrecen mejor control sobre condiciones tales como pH, temperatura, luz y concentración de CO .
- Previenen la evaporación del agua.
Fuente: Martinez AR. Puesta en marcha de un cultivo de microalgas para la eliminación de nutrientes de un agua residual urbana previamente tratada anaeróbicamente. Máster Universitario en Ingeniería Hidráulica y Medio Ambiente. Valencia (España): Universidad Politecnica de Valencia, 2011.
Fuente: Earthship. New Mexico Global Model Earthship [Internet]. Taos(Nuevo México). Earthship Biotecture; 2011[citado 9 Febrero 2014]. Disponible desde: http://earthship.com.
Diseño y construcción del reactor
Material:
Acrílico de 5 y 10 mm
Dimensiones:
30x3x20 cm
Evaluación de la eficiencia del reactor construido
Se realizaron ensayos de productividad comparativos entre el fotobiorreactor de placa plana y un fotobiorreactor tubular.
Esterilización de los reactores
Radiación UV 15 minutos
+
Hipoclorito 1% 15 minutos
Resultado de control de esterilización .A) PDA previo a esterilizar. B) PDA luego de esterilizar C) TSA previo a esterilizar D) TSA luego de esterilizar.
Cepas ensayadas:
Choricystis minor, Scenedesmus armatus, Monoraphidium sp., Raphidocelis subcapitata
Reactor tubular de vidrio
Diámetro: 11 cm
Altura: 23 cm
Curvas de confianza para el seguimiento de los cultivos
Límite de confianza:
límite de detección del equipo a partir del cual el valor de absorbancia medida deja de ser directamente proporcional a la cantidad de biomasa en el cultivo.
Cepa
LC
Choricystis minor
Scendesmus armatus
Monoraphidium sp.
Raphidocelis subcapitata
0,83
Curvas de productividad
Choricystis minor
Scenedesmus armatus
Monoraphidium sp.
Raphidocelis subcapitata
No fue posible obtener resultados confiables.
Adherencia de la cepa tanto en las paredes, fondo y tapa del reactor dificultó en gran medida el seguimiento del cultivo.
Evaluación de los ensayos de productividad
Rediseño del reactor
Inconveniente
Alternativa
Dificultad en la limpieza y esterilización del tubo aireador.
Arqueado de la tapa y bombeo de las caras delanteras y traseras del reactor.
Evaporación del cultivo.
Presencia de cultivo en los algodones de la tapa.
Que el tubo aireador sea desmontable.
Construir el reactor con placas de acrílico de mayor espesor y atornillar la tapa.
Asegurar el correcto sellado del reactor y/o bombear aire con mayor humedad.
Utilizar menor cantidad de volumen del reactor u otro material filtrante.
Aislamiento de microalgas
Enriquecimiento
Tinción Gram

Ampicilina 0,5 y 1 mg/mL
Ampicilina 1 g/L + gentamicina 0,2 g/L
Aumento de pH a 8
Aislamiento
en medio líquido
Dilución en tubo
Aislamiento
en medio semisólido

140 rpm, 24 h Luz, 24-26 °C
Caracterización morfológica
Caracterización molecular

Extracción de lípidos por vía húmeda
Muestreo
Lago Parque Rivera - Lago Rodó Lago Canteras - Laguna de Juanicó - Cañada de Soriano
Contaminación
bacteriana y fúngica

Agar 1,5%
24 h luz, 24-26 °C
¡Muchas gracias!
Aplicaciones - Biocombustibles y Bioelectricidad
Producción de bioetanol
Pretratamiento
Fermentación
Sacarificación

Ensayos previos en medio líquido
Fotosíntesis
Diseño y construcción de un fotobiorreactor de placa plana de escala piloto
Biocombustibles de tercera generación
Las algas y el bioetanol
Producción de bioetanol
Sacarificación
Fermentación
Separación y purificación
Pretratamiento
Criterios de escalado
Diseño y construcción del fotobiorreactor
Pruebas en el reactor
Ensayos de medios de cultivo a escala matraz
Escalado de cultivos
Placa de 6 pocillos
Tubo de vidrio
Tubos de vidrio - 10 mL
Cultivo en matraces - 50 mL
ALGAS
Macroalgas
Ácido
Ácido - Base
Calor
Calor + Buffer
Producción de etanol a partir de diferentes tratamientos de la biomasa
Microalgas
Procariotas
Eucariotas
Cianobacterias (verdeazuladas)
Verdes
Rojas
Doradas
0,90
0,76
0,88
Gráficos para la determinación del límite de confianza de distintas cepas de microalgas.
Curvas de productividad de diferentes cepas de microalgas en reactor tubular y plano.
BIOETANOL
Se diseñó el medio VECP para el cultivo de microalgas.
Se generó una colección de 12 cepas de microalgas de agua dulce aisladas de diferentes zonas del Uruguay
Todas las cepas fueron criopreservadas en glicerol al 9% a -80 °C.
Se diseñó y construyó un
fotobiorreactor
de placa plana a escala de
laboratorio
.

La cepa de
Choricysits minor
presentó una
µ=0,46 d-1
.
Sin embargo, la cepa de
Scenedesmus armatus

presentó la mayor
Qmáx= 0,078 mg/mL.d
en el reactor plano.

Objetivos
Cultivo en matraces - 500 mL
15 cultivos puros
Medio VECP 0,5% v/v
1,4 L/min o 140 rpm
24 h luz, 24-26 °C


Visualización de colonias al microscopio óptico

Guía de microalgas de agua dulce
Secuenciación parcial del gen codificante
para la subunidad 18S del ARNr
Caracterización


Criopreservación
Morfológica
Molecular
Extracción de ADN
Kit “ZR Soil Microbe DNA Miniprep"
Fenol-cloroformo
Electroforesis en gel de agarosa 1,2% en TAE 1X, con agente intercalante Good View, de ADN de microalgas. Carriles: MP- Marcador de peso molecular Fermentas SM0331; M1C, M2C, M3C, M4C. Extracción de ADN con fenol-cloroformo de M1, M2, M3, y M4 respectivamente. M1kit- Extracción de ADN con Kit de extracción de ADN de muestra M1.
Se realizó la extracción de ADN genómico de 15 monocultivos de microalgas utilizando el kit.
Amplificación parcial por PCR del gen ARNr 18S
Puesta a punto de metodología de PCR
Fuente de energía renovable y biodegradable
Disminución de emisiones nocivas
Seguro para su transporte y manejo
Taxonomía
Etapas:
1. Captura de energía eléctrica
2. Producción de ATP y poder reductor
3. Síntesis de moléculas orgánicas
Fotobiorreactor laboratorio
Fotobiorreactor piloto
vvm
Relación sup/vol (cm )
4,15
4,15
Generación del banco de microalgas
vvm
=
______________________________________________
volumen de aire
volumen de líquido de trabajo. minuto
Los criterios de escalado utilizados fueron las
vvm
y la relación
superficie/volumen
.
sup
____
vol
=
superficie de contacto con la luz cm
___________________________________________
volumen de líquido de trabajo cm
Se alcanzó una diferencia de potencial con un máximo en el entorno de
800 mV
en la configuración de
simple cámara
con arena en
circuito abierto
.
En cuanto a la generación de
bioetanol
, el pretratamiento mas efectivo resultó ser con
ácido
(3,51 g/L etanol para las algas y 0,23 g/L para el bagazo de caña, a partir de 1 g de biomasa húmeda)

Se obtuvo
15 veces
más etanol para la biomasa de microalgas tratada con ácido que con cualquiera de los otros tres pretratamientos estudiados.



Material:
Acrílico 10 mm

Dimensiones:
70x5x170 cm

Volumen:
59,5 L
Volumen de trabajo:
44,6 L
Estanqueidad
Funcionamiento de los componentes del reactor
- Pérdidas: uniones de los acrílicos, componentes del reactor, conectores del aireador
- Efecto bombeo
- Sin aireación/ con aireación (caudal 185 L/min)
Llevar a cabo protocolos de sanitización, inoculación, seguimiento y cosecha del fotobiorreactor de placa plana a escala piloto en la escuela
Funcionamiento del fotobiorreactor
de placa plana a escala piloto en la escuela.
Instalación estratégica del fotobiorreactor de placa plana a escala piloto en la escuela.
- Conector de entrada de líquidos
- Cosecha por canillas
- Integridad del aireador
- Desmontar el tubo aireador
- Salida de gases por la tapa
Secuenciación y análisis bioinformático
Se utilizan 7 juegos de primers
La información de la caracterización morfológica es
complementaria
para llegar a niveles de especie.
Volumen:
1800 cm
Evaluar la posibilidad de acumulación de potencial por un cultivo de microalgas
Volumen de trabajo:
1350 cm
Evaluación del protocolo de extracción de lípidos por vía húmeda y estudio de la productividad lipídica de diferentes cepas de microalgas
Analizar diferentes pretratamientos de biomasa de microalgas y bagazo de caña para la producción de bioetanol
¿Qué es escalar?
Semejanza entre dos sistemas:
crecimiento del microorganismo
producto deseado.
V= 1,35 L
V= 44,6 L
ILUMINACIÓN-AIREACIÓN-CONCENTRACIÓN CO
CAUDAL (L/min)
Medios:
BG11
BG11 extracto de suelo
BG11 extracto de levadura
Cepa:
Choricystis minor
Se evaluaron distintos medios para seleccionar con cuál de ellos se alcanza mayor productividad en el menor tiempo, teniendo en cuenta el costo de cada medio
Se amplificó el gen ARNr 18S de 15 cepas de microalgas
Aislamiento
Verificar la pureza
de la colonia al microscopio óptico
10% de inóculo
¿Que es criopreservar?
Medio BG11+ extracto de suelo
- Proporciona estabilidad frente a cambios genéticos en el tiempo.

- Respaldo frente a inconvenientes

Criopreservante: glicerol al 9%
En freezer a -80 °C
Ensayos de descongelado de los cultivos
Se llevaron a cabo dos metodologías de descongelado de los cultivos criopreservados con el fin de asegurar la
viabilidad
de las cepas

y la
fiabilidad
del banco creado.
Método de raspado
Descongelado en baño
Es el uso de temperaturas muy bajas para preservar estructuralmente intactas a células vivas.
Criotubo 2mL
-80°C
Raspar estéril con ansa metálica
Tubo 10 mL

140 rpm, 24-26°C
fotoperíodo 16:8 h
Baño a 35 °C
Centrifugar a 200 g, 7 min. Agregar medio BG11
140 rpm, 24-26°C
fotoperíodo 16:8 h
Criotubo 2mL
-80°C
Ambos métodos de descongelado resultaron exitosos
3000




1000





500
3000



1000
500
3000



1000
500
Se obtuvieron 15 cultivos puros de microalgas correspondientes a 12 cepas diferentes.
Estrategias nutricionales
Grupo nutricional
Fotoautótrofos
Fotoheterótrofos
Fuente de carbono
Fuente de energía
CO
2
Luz
Compuesto orgánico
Luz
2
Las microalgas contienen carbohidratos (glucosa, celulosa, almidón y otros polisacáridos) los cuales pueden ser utilizados como fuente de carbono para la fermentación por levaduras.
2
2
2
3
3
Medio VECP
0,5% v/v - 0,9 % v/v -
1,4 % v/v



Medio BG11+ extracto

de suelo 2,5%
(120 ºC 1 h)
Acetato de Sodio 0,05 M
pH 5,5
(Ac Sulfúrico)
MS04 de
E.coli

Alga:
Raphidocelis subcapitata
Control: BG11
Pte salino: Sulfato de sodio
Circuito abierto
La biomasa de microalgas se utilizará como biofertlizante en la huerta de la escuela
Disminución de dióxido de carbono y mejora de la calidad del aire
Realización de talleres con los niños y la comunidad de la zona
Utilización de biomasa húmeda

Efectividad en remoción de la clorofila

Optimización del protocolo

Optimización de las condiciones de cultivo
En resumen:
Bibliografía:
20 - 30 %
Monoraphidium sp.
25 - 50 %
C.minor
46 %
S.armatus
Se evaluaron posibles aplicaciones de las microalgas para la obtención de biocombustibles
Se diseñó y construyó un
fotobiorreactor
de placa plana a
escala piloto
para su posterior instalación en una escuela autosustentable.
Fuente: Asociación acuaristas de Venezuela 2007
Fuente: greenCostaRica. Microalgas fijan CO 2013
2
Fuente: Leliaert F,
et al
. Phylogent and molecular evolution of the green algae. Critical Reviews in Plant Sciences. 2012.
Analisis comparativo de costos y beneficios de los posibles medios de cultivo VECP y BG11
1,4 L/min
Biofertilizante
Agitación en Shaker, 140 rpm
Paso previo el escalado
:
Tubo 10 mL o Matraz 50 mL
Se logró la criopreservación de una colección de 15 monocultivos de microalgas aisladas a partir de muestras de agua dulce del Uruguay.
Fotoperíodo 16:8 h
Alta contenido de nitrógeno
Bajo costo y alta aplicabilidad
Cepa
Fuente: Richmond A. Handbook microalgal culture. Victoria: Blackwell Science; 2004.
Abierto
Cerrado
Fuente: Walter C, Posten C. Microalgal biotechnology: potential and production. Posten C. Berlin: De Gruyter; 2012.
410 mg/L.d
Haematococcus pluvialis
76 mg/L.d
Fuente: Katarzyna L, Sai G, Singh OA. Non- enclosure methods for non suspended microalgae cultivation: literature reviews and research needs. Renwable and Sustainable Energy Reviews. 2015; 42: 1418-1427.
Fertilizantes comerciales:

5-40 % Nitrógeno total
http://vidamasverde.com/2012/algas-materia-prima-para-produccion-de-biocombustibles-en-chile.
Análisis fisicoquímico de suelos sometidos a diferentes tratamientos con el consorcio y con el fertilizante químico
Fuente: Production of Bioethanol Using
Chlorella vulgaris
. Ho S.H, Huang S, Chen C, Hasunuma T, Chang J. Bioresource Technology. 2013; 135: 157–165.
SAI- suelo antes de inoculación.
TCC- suelo inoculado con el consorcio.
TFQ- suelo inoculado con fertilizante químico.
Fuente: Gouveia L. From Tiny Microalgae to Huge Biorefineries. Oceanography. 2014; 2:1.
Análisis bromatológico de la biomasa de
Chlorella sp.
Fuente: Sustainable Green Technologies Inc.Algae FAC. 2008
Adaptada de: ainiacomunidad. Blogs de Tecnología.

Fuente: Biorizon- algafert.
Fuente: Jacobo J. Evaluación tecno-económica de la producción de biocombustibles a partir de microlagas. 2011
Fuente: Morales E,
et al
. Aislamiento, cultivo, viabilidad y evaluación de un consorcio cianobacteria-microalga como acondicionador de suelos.
celulasa
3
2
-1
Electroforesis en gel de agarosa 1,2% en TAE 1X, visualizado con Good View, para el análisis de la amplificación por PCR del gen codificante para la subunidad 18S del ARNr de las muestras J, K, Q, R y H con primer A4 en gel 1, y las muestras J, K, Q, T y R con primer A2 en gel 2. Gel 1: MP- Marcador de peso molecular Fermentas SM0331; JA4- Amplificación de J; KA4- Amplificación de K; QA4- Amplificación de Q; HA4- Amplificación de H; RA4- Amplificación de R; C+- Control positivo; B- Blanco. Gel 2: MP; B; C+; JA2- Amplificación de J; KA2- Amplificación de K; QA2- Amplificación de Q; TA2- Amplificación de T; RA2- Amplificación de R.
Bomba de pecera
Manguera plástica
Filtro 0,22 uM
Tapón de algodón
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