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Técnicas para el Análisis, Cuantificación e Identificación de Metabolitos Secundarios.

Trabajo realizado para la asignatura Metabolismo Vegetal, del Máster Oficial "Avances en Biología Agraria y Acuicultura". Facultad de Ciencias, Universidad de Granada (UGR). España. Autoras: Alhaj-Salih Ortega, S.; Barquiel Alcalá, P.
by

Saria Alhaj-Salih Ortega

on 3 December 2015

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Transcript of Técnicas para el Análisis, Cuantificación e Identificación de Metabolitos Secundarios.

Introducción
Una de las dificultades de la cromatografía es que puede haber diferentes compuestos que presenten el mismo comportamiento. En consecuencia, las mejores técnicas de análisis cualitativo son aquéllas que combinan la capacidad de separación de la cromatografía con la capacidad de la identificación de técnicas como la espectrometría de masas (técnicas acopladas).

La asociación de las dos técnicas,
permite la separación e identificación de mezclas complejas
.
Técnicas para el análisis, cuantificación e identificación de metabolitos secundarios.
Alhaj-Salih Ortega, S. & Barquiel Alcalá P.
Índice
-Introducción
-Preparación de la muestra
-Hidrólisis
-Extracción
-Métodos de identificación, cuantificación y análisis
-Bibliografía
Los metabolitos son
extraídos
de los tejidos de las plantas con
metanol-agua
y después de un tratamiento simple de filtración/extracción de fase sólida, la masa
analizada
es manejada por un
scáner
, que detecta rangos de metabolitos.
Además de los
procesos metabólicos primarios
que conducen a la
formación
de compuestos como
azucares simples
, aminoácidos; también se sintetizan
metabolitos secundarios
, creados a partir de rutas del metabolismo secundario.

Los metabolitos secundarios poseen
importancia fisiológica
,
ecológica
, sirven como señales que integran la
diferenciación celular
y el
metabolismo
en diferentes partes del organismo vegetal pluricelular.

Hay metabolitos secundarios que constituyen un
mecanismo de defensa
frente al ataque de
bacterias
,
virus
y
hongos
.

El
ácido siquímico
, el
acetato
o los
aminoácidos
son moléculas del
metabolismo primario
que constituyen los materiales de partida para las
rutas del metabolismo secundario
.

El
ácido siquímico
origen
aminoácidos aromáticos
y
polifenoles
. El
acetato
precursor de
ácidos grasos
y
policétidos
y
terpenos
,
isoprenoides
y
antibióticos peptídicos
.

Se ha incentivado y sobre todo en los últimos años la
investigación
y el
desarrollo
de técnicas para su
identificación
,
análisis
y
cuantificación
.

Principales grupos de metabolitos secundarios:
Terpenos
,
Alcaloides
y
Compuestos fenólicos
.
Terpenos
Se
sintetizan
a partir del compuesto C5
isopentenil difosfato
, considerado el isopreno activo.
Se
clasifican
según el número de
unidades
teóricas de
isopreno
de que se componen.

Clasificación de los terpenos:
-Monoterpenos
-Sesquiterpenos
-Diterpenos
-Triterpenos
-Tetraterpenos
-Politerpenos
Figura 1. Rutas biosintéticas de los precursores isoprenoides, a partir de las que dan lugar a la formación de terpenos citoplasmáticos o cloroplásticos
Compuestos fenólicos
Alcaloides
Compuestos de
estructura aromática
, con uno o varios
grupos hidroxilo
libres o sustituidos. El
compuesto básico
es el
fenol
, pero la mayoría de estos compuestos son polifenoles.

Se clasifican según el número de átomos de carbono de su estructura básica:

-Compuestos nitrogenados fenólicos
-Fenoles simples
-Derivados con cadenas laterales de carbono
-Ácidos hidroxicinámicos
-Quinonas fenólicas
-Cumarinas
-Lignanos
-Estilbenos
-Polímeros fenólicos
Figura 2. Estructura química de fenoles
Los
polifenoles
tienen importancia económica puesto que
contribuyen
al
sabor
, el
aroma
y el
color
de alimentos y bebidas.
En la naturaleza, desempeñan un
papel importante
en la
protección de la planta
frente a los depredadores. También actúan como
señales químicas
en la
floración
y
polinización
de las plantas y en los
procesos de simbiosis vegetal
.
Figura 3. Composición química de los alcaloides
La
importancia
de los alcaloides para la planta es que constituyen una
reserva de nitrógeno
para ella y al mismo tiempo, pueden
actuar
como
sustancias alelopáticas
o como
disuasorios alimentarios
con lo que contribuyen a la
defensa del vegetal
frente a la competencia con otras especies vegetales o el ataque de determinados patógenos o depredadores.

Los alcaloides se agrupan según los aminoácidos de los que proceden:
-Derivados de la ornitina y la lisina
-Derivados de los aminoácidos aromáticos fenilalanina y tirosina
-Derivados del aminoácido aromático triptófano y una parte derivada del ácido mevalónico
-Protoalcaloides
-Pseudoalcaloides

Preparación de la muestra
Los compuestos fenólicos son un grupo grande y heterogéneo de metabolitos secundarios de plantas que incluyen entre otros taninos.

Generalmente
liofilizada,

muestras secas
ó
congeladas
. Se emplea
tierra en polvo
para evitar la
degradación del material.


La
liofilización
seguida de
molienda
implica una
rotura mecánica
y permite un
contacto
más
directo
entre los compuestos de interés y la solución de extracción.
Hidrólisis
Para un previo
análisis
de metabolitos secundarios:
hidrólisis.

Puede ser
ácida
,
alcalina
o
enzimática.


Hidrólisis ácida
, implica el
tratamiento
de la muestra vegetal con
ácidos orgánicos
tales como
ácido clorhídrico
o sulfúrico.

La
hidrólisis alcalina
se realiza generalmente utilizando una
solución
de
hidróxido de sodio 1-4 M.

Hidrólisis enzimática,
en desuso.
Extracción
-LSE: extracción líquido-sólido:
son utilizados
disolventes
orgánicos. Se recomienda un cierto porcentaje de
agua
en la mezcla de extracción.

-Extracción fraccionada
: permite analizar
metabolitos secundarios
en sus formas
libres
o
conjugados
. Implica un
consumo
grande de
disolventes
.

-
UAE=Extracción asistida por ultrasonido
: utiliza
energía
en forma de
ondas sonoras acústicas ó ultrasónicas.
-MAE=Extraccion asistida por microondas
permite una
rápida
extracción de solutos a partir de
matrices sólidas
. Consiste en calentar el
disolvente orgánico
líquido junto con la muestra con
radiación electromagnética
. Se lleva a cabo una
migración electroforética
de los portadores de carga (iones y electrones) bajo la influencia del campo eléctrico producido por microondas. Depende de la
temperatura
y de la
naturaleza
del agente de extracción.
La
energía
generada en forma de calor es
absorbida
eficientemente por algunas
sustancias
dentro de los
materiales vegetales
, especialmente las moléculas polares como el agua. El
sobrecalentamiento
interior puede causar la
vaporización
de líquido dentro de las células, lo que puede
romper
las
paredes de las células y / o membranas plasmáticas.
-SPE=Extraccion en fase sólida:
un
menor
gasto de
disolvente
, es más
reproducible
y aún más
rápida
. Se utiliza a menudo para
eliminar
las sustancias que
interfieren
en los extractos en crudo, lo que permite un mejor aislamiento de metabolitos secundarios y su determinación.

-Otras técnicas de extracción:

MSPD
, estrategia
sencilla
y
flexible
de preparación de muestras, aplicada para
muestras sólidas
. La muestra se mezcla con un soporte sólido abrasivo.
UAE
= extracción de reflujo,
PHWE
=extracción de agua caliente a presión.
Sus cualidades son:
Capacidad de identificación
de forma prácticamente
inequívoca.
Cuantitativa
: permite
medir la concentración
de las sustancias.
Gran sensibilidad
: ppm o ppb.
Universal y específica
.
Proporciona
información estructural
sobre la molécula analizada.
Suministra
información isotópica
.
Es una
técnica rápida
: décimas de segundo.

Dentro del espectrómetro de masas, se procede a la
ionización de la muestra
.
La detección consecutiva de los iones formados, produce el espectro de masas de la sustancia, que es diferente para cada compuesto químico.

Métodos de identificación, cuantificación y análisis
La muestra se
inyecta
en la
fase móvil
, la cual es un gas inerte (generalmente He).
La cromatografía de gases se emplea cuando los componentes de la mezcla problema son
volátiles o semivolátiles
y térmicamente
estables
a temperaturas de hasta
350-400ºC
.
Cada soluto presente en la muestra tiene una afinidad diferente hacia la fase estacionaria.
Un factor clave es la
presión de vapor
de los compuestos. Como consecuencia de esta
diferencia de movilidad
, los diversos componentes de la muestra se separan en
bandas
que pueden analizarse mediante el empleo de los detectores seleccionados.
Existen
tres técnicas básicas de inyección de muestras
(líquidas o gaseosas) en columnas capilares:
split, split-less y on column
.
En los análisis metabolómicos utilizando CE-MS, las muestras suelen dividirse por
cationes
y
aniones
. Se utiliza preferentemente para el análisis de cationes aminoácidos, ácidos orgánicos, nucleótidos y fosfatos. Se ha utilizado esta técnica ampliamente para identificación de
biomarcadores
para la progresión del
cáncer
y de estrés oxidativo.
El HPLC es una técnica utilizada para separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de
interacciones químicas
entre las sustancias analizadas y la columna cromatográfica.
El compuesto pasa por la columna cromatográfica a través de la fase estacionaria mediante el bombeo de líquido (fase móvil) a alta presión a través de la columna.
Hay diferentes tipos de HPLC:
-NP-HPLC (cromtografía normal)
-Cromatografía de fase reversa (RP-HPLC)
-Cromatografía de exclusión molecular o por filtración en gel
-Cromatografía de intercambio iónico
-Cromatografía de bioafinidad
-HPLC en condiciones desnaturalizantes

Identificación de QTLs asociados a la síntesis de metabolitos secundarios para desarrollar
germoplasma

resistente
mediante selección asistida por
marcadores moleculares
.
Los QTLs son locus cuya variación alélica está asociada con la variación de un
carácter cuantitativo
, es decir, con aquellos caracteres cuantificables que varían de forma continua.
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Bibliografía
Cromatografía de gases
Espectrometría de masas
Cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS)
Comatrografía liquida-Espectrometría de masas (LC-MS)
Electroforesis capilar –Espectrometría de Masas (CE-MS)
Aplicación de QTLs
HPLC = Cromatografía líquida de alta resolución
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